| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 文中使用的英文缩写列表 | 第14-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-55页 |
| 1 极端环境微生物和极端酶 | 第16-24页 |
| 1.1 极端环境微生物概述 | 第16-18页 |
| 1.2 极端酶概述 | 第18-19页 |
| 1.3 嗜热酶 | 第19-21页 |
| 1.4 嗜冷酶 | 第21-23页 |
| 1.5 适应不同温度的酶在应用中的局限性 | 第23-24页 |
| 2 蛋白酶概述 | 第24-41页 |
| 2.1 丝氨酸蛋白酶 | 第25-27页 |
| 2.2 枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶(Subtilase) | 第27-29页 |
| 2.3 嗜热蛋白酶WF146、嗜温蛋白酶Spheriease和嗜冷蛋白酶S41概述 | 第29-35页 |
| 2.4 蛋白酶温度适应机制的研究现状 | 第35-36页 |
| 2.5 蛋白质(酶)的活性与稳定性 | 第36-41页 |
| 3 蛋白质工程 | 第41-51页 |
| 3.1 定向进化 | 第42-46页 |
| 3.2 理性设计 | 第46-50页 |
| 3.3 半理性设计 | 第50-51页 |
| 4 包含体及其变性复性 | 第51-52页 |
| 5 本研究的背景、内容和意义 | 第52-55页 |
| 第二章 材料与方法 | 第55-77页 |
| 1 实验材料 | 第55-60页 |
| 1.1 菌种、质粒和野生型酶基因 | 第55页 |
| 1.2 药品以及试剂 | 第55-56页 |
| 1.3 培养基及溶液配制 | 第56-60页 |
| 2 实验方法 | 第60-77页 |
| 2.1 重组质粒的提取 | 第60-61页 |
| 2.2 PCR方法 | 第61-66页 |
| 2.3 重组质粒的构建 | 第66-68页 |
| 2.4 蛋白质电泳检测 | 第68-69页 |
| 2.5 蛋白质浓度及酶活测定 | 第69-71页 |
| 2.6 定向进化筛选方法 | 第71-72页 |
| 2.7 重组酶的表达 | 第72页 |
| 2.8 野生型及其突变体蛋白酶的Ni~(2+)亲和层析纯化 | 第72页 |
| 2.9 杆菌肽亲和层析纯化 | 第72-73页 |
| 2.10 包含体的提取与复性 | 第73-74页 |
| 2.11 蛋白质N末端测序 | 第74-75页 |
| 2.12 质谱分析蛋白质分子量 | 第75页 |
| 2.13 蛋白酶稳定性的分析 | 第75-76页 |
| 2.14 酶动力学参数测定 | 第76-77页 |
| 第三章 蛋白酶WF146、Sph及S41的随机重组与嵌合体性质分析 | 第77-93页 |
| 1 蛋白酶WF146、Sph和S41基本性质比较 | 第77-82页 |
| 1.1 氨基酸组成及三维结构比较 | 第77-79页 |
| 1.2 重组质粒构建及重组酶温度相关性质比较 | 第79-82页 |
| 2 酶原的随机重组及嵌合体性质分析 | 第82-87页 |
| 2.1 随机重组与初筛 | 第82-83页 |
| 2.2 复筛及嵌合体活性分析 | 第83-86页 |
| 2.3 酶原随机重组结果分析 | 第86-87页 |
| 3 成熟酶区的随机重组及嵌合体性质分析 | 第87-90页 |
| 3.1 重组策略 | 第87页 |
| 3.2 嵌合体活性分析 | 第87-89页 |
| 3.3 成熟酶随机重组结果分析 | 第89-90页 |
| 4 讨论 | 第90-91页 |
| 5 本章小结 | 第91-93页 |
| 第四章 嗜热蛋白酶WF146中非保守区/位点的系统突变及温度相关性质分析 | 第93-117页 |
| 1 蛋白酶WF146中非保氨基酸位点和区域的系列突变 | 第93-97页 |
| 1.1 蛋白酶WF146突变体库构建策略 | 第93-94页 |
| 1.2 重组质粒的构建 | 第94-96页 |
| 1.3 重组酶的表达及纯化 | 第96-97页 |
| 2 野生型与突变体酶温度相关的性质比较 | 第97-101页 |
| 2.1 野生型与突变体酶热稳定性比较 | 第97-98页 |
| 2.2 野生型与突变体酶活性比较 | 第98-100页 |
| 2.3 WA和WB组突变体活性和稳定性关系分析 | 第100-101页 |
| 3 热稳定性和活性提高突变体的重组 | 第101-113页 |
| 3.1 热稳定性提高突变体的重组及筛选 | 第101-102页 |
| 3.2 低温活性提高的突变体的重组及筛选 | 第102-103页 |
| 3.3 突变体PBL5X与WT性质比较 | 第103-113页 |
| 4 讨论 | 第113-116页 |
| 5 本章小结 | 第116-117页 |
| 总结与展望 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-133页 |
| 附录 | 第133-149页 |
| 附录1 本研究中用到的引物序列 | 第133-139页 |
| 1.1 StEP PCR所用的引物序列 | 第133-134页 |
| 1.2 蛋白酶WF146非保守区/位点系统突变和重组用到的引物 | 第134-139页 |
| 附录2 本研究中用到的质粒信息汇总 | 第139-149页 |
| 2.1 StEP PCR使用的质粒及其详细信息 | 第139-140页 |
| 2.2 构建WA和WB嵌合体库及其进一步重组的质粒的相关信息 | 第140-145页 |
| 2.3 WA和WB嵌合体库及其进一步重组的质粒包含的突变位点汇总 | 第145-149页 |
| 在读期间已发表论文 | 第149-150页 |
| 致谢 | 第150-151页 |
