| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 目录 | 第5-7页 |
| 第一章 前言 | 第7-17页 |
| 1.1 环境中的铬 | 第7-8页 |
| 1.2 生物体中铬的跨膜运输和毒性机制 | 第8-9页 |
| 1.3 生物体的抗铬机制 | 第9-13页 |
| 1.3.1 细菌的抗铬机制 | 第9-12页 |
| 1.3.2 动物细胞的抗铬机制 | 第12-13页 |
| 1.4 大肠杆菌铬还原酶YieF的铬还原机制 | 第13-15页 |
| 1.5 研究意义和目的 | 第15-17页 |
| 第二章 材料方法 | 第17-24页 |
| 2.1 表达载体pCI-neo-yieF和pEGFP-N1-yieF的构建 | 第17-19页 |
| 2.1.2 大肠杆菌(DH5a)的培养 | 第17页 |
| 2.1.3 PCR扩增目的片段yieF | 第17-18页 |
| 2.1.4 PCR产物的回收 | 第18页 |
| 2.1.5 双酶切、连接和转化 | 第18-19页 |
| 2.1.6 重组质粒测序和比对 | 第19页 |
| 2.1.7 重组质粒的提取 | 第19页 |
| 2.2 细胞培养、转染和稳转细胞的筛选 | 第19-20页 |
| 2.2.1 细胞培养 | 第19-20页 |
| 2.2.2 细胞转染 | 第20页 |
| 2.2.3 稳定转染细胞的筛选 | 第20页 |
| 2.3 验证目的基因yieF插入细胞基因组DNA | 第20页 |
| 2.3.1 提取细胞基因组DNA | 第20页 |
| 2.3.2 PCR扩增目的基因 | 第20页 |
| 2.4 RT-PCR定性检测目的基因yieF在mRNA水平上的表达 | 第20-21页 |
| 2.4.1 提取细胞总RNA | 第20页 |
| 2.4.2 反转录 | 第20-21页 |
| 2.4.3 RT-PCR扩增目的基因 | 第21页 |
| 2.5 MTT实验测定细胞存活率 | 第21页 |
| 2.6 细胞Cr(Ⅵ)还原能力的测定 | 第21-22页 |
| 2.7 细胞粗体液Cr(Ⅵ)还原能力的测定 | 第22页 |
| 2.8 荧光定量qRT-PCR测定mRNA水平上的相对表达量 | 第22页 |
| 2.8.1 qRT-PCR模板制备 | 第22页 |
| 2.8.2 荧光定量qRT-PCR | 第22页 |
| 2.9 融合蛋白YieF-EGFP的表达定位 | 第22-24页 |
| 2.9.1 细胞爬片 | 第22-23页 |
| 2.9.2 细胞转染 | 第23页 |
| 2.9.3 细胞固定、染色及封片 | 第23页 |
| 2.9.4 细胞观察 | 第23-24页 |
| 第三章 结果 | 第24-34页 |
| 3.1 大肠杆菌中铬还原酶基因yieF的克隆 | 第24页 |
| 3.2 PCR检测稳定转染细胞(HepG2-YieF)基因组中yieF的存在 | 第24-25页 |
| 3.3 目的基因yieF在mRNA水平上表达的定性检测 | 第25-26页 |
| 3.4 细胞存活率的检测 | 第26-27页 |
| 3.5 HepG2-YieF细胞降低培养环境中Cr(Ⅵ)浓度 | 第27-28页 |
| 3.6 HepG2-YieF细胞粗提液与Cr(Ⅵ)的相互作用 | 第28-30页 |
| 3.7 yieF及Cr(Ⅵ)还原相关基因的相对表达量 | 第30-31页 |
| 3.8 融合蛋白YieF-EGFP的表达定位 | 第31-32页 |
| 3.9 小结 | 第32-34页 |
| 第四章 结论和讨论 | 第34-37页 |
| 4.1 HepG2-YieF表达模型的成功构建 | 第34页 |
| 4.2 YieF具有较高的Cr(Ⅵ)还原效率 | 第34-35页 |
| 4.3 YieF在Cr(Ⅵ)还原过程中对细胞的保护作用 | 第35-36页 |
| 4.4 进一步的研究方向和前景 | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-44页 |
| 附录 | 第44-45页 |
| 致谢 | 第45页 |
