| 中文摘要 | 第4-8页 |
| 英文摘要 | 第8-12页 |
| 目录 | 第13-16页 |
| 符号说明 | 第16-17页 |
| 1 前言 | 第17-20页 |
| 2 TWIST过表达及干扰稳定细胞系的构建 | 第20-44页 |
| 2.1 引言 | 第20页 |
| 2.2 材料 | 第20-23页 |
| 2.2.1 主要实验试剂 | 第20-21页 |
| 2.2.2 主要仪器设备 | 第21页 |
| 2.2.3 主要溶液配置 | 第21-23页 |
| 2.3 方法 | 第23-34页 |
| 2.3.1 pMD19-T-TWIST质粒的鉴定 | 第23页 |
| 2.3.2 TWIST基因片段克隆至pCDNA3.1(+) | 第23-28页 |
| 2.3.3 Saos-2-TWIST稳定表达细胞系构建 | 第28-33页 |
| 2.3.4 MG63-TWIST-shRNA稳定干扰细胞系构建 | 第33-34页 |
| 2.4 结果 | 第34-39页 |
| 2.4.1 pMD19-T-TWIST质粒的鉴定结果 | 第34-35页 |
| 2.4.2 TWIST基因的PCR扩增结果 | 第35-36页 |
| 2.4.3 pCDNA3.1(+)-TWIST重组质粒的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.4.5 Saos-2-TWIST稳定表达细胞系的构建及鉴定 | 第37-38页 |
| 2.4.6 MG63-TWIST-shRNA稳定干扰细胞系的构建及鉴定 | 第38-39页 |
| 2.5 讨论 | 第39-43页 |
| 2.6 结论 | 第43-44页 |
| 3 TWIST与ET-1及ETAR受体信号的相互作用对顺铂作用下的骨肉瘤细胞生存率的影响研究 | 第44-65页 |
| 3.1 引言 | 第44页 |
| 3.2 材料 | 第44-46页 |
| 3.2.1 主要实验试剂 | 第44-45页 |
| 3.2.2 主要仪器设备 | 第45页 |
| 3.2.3 主要溶液配置 | 第45-46页 |
| 3.3 方法 | 第46-55页 |
| 3.3.1 细胞复苏、培养与传代 | 第46-48页 |
| 3.3.2 细胞分组及处理 | 第48-49页 |
| 3.3.3 Western blot检测TWIST、ET-1表达水平 | 第49页 |
| 3.3.4 ELISA检测各组细胞分泌ET-1水平 | 第49-50页 |
| 3.3.5 Realtim PCR检测各组细胞ET-1的mRNA水平 | 第50-52页 |
| 3.3.6 Tunel检测各组细胞凋亡情况 | 第52-54页 |
| 3.3.7 Western blot检测磷酸化p-AKT(Ser473)、总AKT表达水平 | 第54-55页 |
| 3.4 结果 | 第55-61页 |
| 3.4.1 Western blot检测TWIST、ET-1的表达水平 | 第55-56页 |
| 3.4.2 ELISA检测各组细胞分泌ET-1水平 | 第56页 |
| 3.4.3 Realtime PCR检测ET-1的mRNA水平 | 第56-57页 |
| 3.4.4 Tunel检测细胞的凋亡率 | 第57-60页 |
| 3.4.5 Western blot检测磷酸化p-AKT的表达 | 第60-61页 |
| 3.5 讨论 | 第61-64页 |
| 3.6 结论 | 第64-65页 |
| 4 MIR-33A通过下调TWIST提高骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性 | 第65-84页 |
| 4.1 引言 | 第65页 |
| 4.2 材料 | 第65-66页 |
| 4.2.1 主要实验试剂 | 第65-66页 |
| 4.2.2 主要仪器设备 | 第66页 |
| 4.3 方法 | 第66-69页 |
| 4.3.1 研究对象 | 第66-67页 |
| 4.3.2 miRNA芯片分析 | 第67页 |
| 4.3.3 Western blot检测筛选试验组样本TWIST的表达 | 第67页 |
| 4.3.4 双荧光素酶检测 | 第67-68页 |
| 4.3.5 检测验证试验组样本中miR-33a和TWIST的表达水平检测 | 第68页 |
| 4.3.6 Western检测转染miR-33a/antagomir-33a后骨肉瘤细胞TWIST的表达 | 第68-69页 |
| 4.3.7 TUNEL检测细胞凋亡情况 | 第69页 |
| 4.3.8 数据分析 | 第69页 |
| 4.4 结果 | 第69-79页 |
| 4.4.1 miRNA表达谱分析 | 第70-71页 |
| 4.4.2 筛选靶向干扰TWIST的miRNA | 第71-74页 |
| 4.4.3 高表达或抑制miR-33a对骨肉瘤细胞中TWIST表达的影响 | 第74-77页 |
| 4.4.4 miR-33a在TWIST抑制的骨肉瘤细胞对顺铂耐药性的作用 | 第77-79页 |
| 4.5 讨论 | 第79-83页 |
| 4.6 结论 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-89页 |
| 综述 | 第89-100页 |
| 参考文献 | 第95-100页 |
| 攻读学位期间主要的科研成果目录 | 第100-101页 |
| 致谢 | 第101页 |
