| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-21页 |
| 1.1 谷氨酸棒杆菌 | 第9-12页 |
| 1.1.1 谷氨酸棒杆菌的生物特性 | 第9页 |
| 1.1.2 谷氨酸棒杆菌的广泛应用 | 第9-12页 |
| 1.2 谷氨酸棒杆菌中基因修饰技术的研究现状 | 第12-14页 |
| 1.2.1 基因修饰技术 | 第12-13页 |
| 1.2.2 基因组修饰技术 | 第13-14页 |
| 1.3 基于双链断裂的基因编辑技术 | 第14-17页 |
| 1.3.1 基于双链断裂的基因编辑技术的研究现状 | 第14-17页 |
| 1.3.2 I-SceI核酸内切酶的应用 | 第17页 |
| 1.4 Red/ET重组 | 第17-19页 |
| 1.5 选题背景与研究思路 | 第19-21页 |
| 1.5.1 选题背景 | 第19页 |
| 1.5.2 研究思路与技术路线 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-27页 |
| 2.1.1 实验菌株、质粒与培养条件 | 第21-24页 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 | 第24页 |
| 2.1.3 主要溶液 | 第24-26页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第26-27页 |
| 2.2 基本操作技术 | 第27-35页 |
| 2.2.1 质粒及基因组DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.2 PCR反应体系及反应条件 | 第28-29页 |
| 2.2.3 CPEC反应体系及条件 | 第29-30页 |
| 2.2.4 酶切与连接 | 第30-31页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第31-34页 |
| 2.2.6 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第34-35页 |
| 2.3 单交换重组体的筛选 | 第35-36页 |
| 2.4 双交换重组体的筛选 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第37-64页 |
| 3.1 upp基因的敲除及其作为负筛选标记有效性分析 | 第37-42页 |
| 3.1.1 敲除质粒pDsacB-Δupp的构建 | 第37-39页 |
| 3.1.2 谷氨酸棒杆菌upp基因敲除菌株的构建 | 第39-40页 |
| 3.1.3 5-FU筛选浓度的确定 | 第40-42页 |
| 3.2 通用载体的构建 | 第42-51页 |
| 3.2.1 单交换通用载体的构建 | 第42-43页 |
| 3.2.2 双交换重组通用载体的构建 | 第43-45页 |
| 3.2.3 辅助表达质粒pEC-XK99E-SceI-recET的构建 | 第45-51页 |
| 3.3 upp与sacB的负筛选效率比较 | 第51-54页 |
| 3.3.1 基因单交换重组的ldhA基因敲除载体的构建 | 第51-53页 |
| 3.3.2 负筛选效率分析 | 第53-54页 |
| 3.4 双交换重组系统的构建 | 第54-64页 |
| 3.4.1 双交换重组载体的构建 | 第54-56页 |
| 3.4.2 双交换敲除载体的应用 | 第56-59页 |
| 3.4.3 IPTG诱导I-SceI表达的诱导浓度及时间的确定 | 第59-60页 |
| 3.4.4 基于PCR片段的双交换重组 | 第60-63页 |
| 3.4.5 辅助质粒pEC-XK99E-SceI-recET的消除 | 第63-64页 |
| 第四章 结论与展望 | 第64-66页 |
| 4.1 结论 | 第64页 |
| 4.2 展望 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
