| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一章 绪论 | 第12-21页 |
| 1.1 重要手性砌块——(R)-1,3-丁二醇 | 第12-13页 |
| 1.1.1 (R)-1,3-丁二醇的性质和用途 | 第12-13页 |
| 1.2 (R)-1,3-丁二醇的合成方法 | 第13-15页 |
| 1.2.1 化学合成法 | 第13页 |
| 1.2.2 生物催化法 | 第13-15页 |
| 1.3 羰基还原酶 | 第15-20页 |
| 1.3.1 羰基还原酶的作用机理 | 第16-17页 |
| 1.3.2 辅酶的循环策略 | 第17-18页 |
| 1.3.3 羰基还原酶的来源 | 第18-19页 |
| 1.3.4 羰基还原酶的克隆与表达 | 第19-20页 |
| 1.4 本论文研究内容 | 第20-21页 |
| 第二章 Leifsonia aquatica羰基还原酶基因的克隆、表达及序列分析 | 第21-40页 |
| 2.1 前言 | 第21页 |
| 2.2 材料与方法 | 第21-29页 |
| 2.2.1 材料 | 第21-23页 |
| 2.2.1.1 菌种与质粒 | 第21-22页 |
| 2.2.1.2 培养基 | 第22页 |
| 2.2.1.3 工具酶及试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.1.4 主要实验仪器 | 第23页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第23-29页 |
| 2.2.2.1 L.aquatica ZJB-09230基因组DNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.2.2 羰基还原酶基因的PCR扩增 | 第24-25页 |
| 2.2.2.3 电泳检测PCR产物 | 第25页 |
| 2.2.2.4 羰基还原酶基因的克隆 | 第25-26页 |
| 2.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.2.2.6 目的基因的转化 | 第26页 |
| 2.2.2.7 菌落PCR | 第26-27页 |
| 2.2.2.8 重组质粒的抽提 | 第27页 |
| 2.2.2.9 序列分析、同源建模 | 第27-28页 |
| 2.2.2.10 CR在大肠杆菌中的异源表达 | 第28页 |
| 2.2.2.11 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr羰基还原酶酶活测定方法 | 第28-29页 |
| 2.2.2.12 (R)-1，3-BDO的光学纯度分析 | 第29页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第29-39页 |
| 2.3.1 基因组DNA的提取及PCR扩增 | 第29-30页 |
| 2.3.2 羰基还原酶基因克隆 | 第30-31页 |
| 2.3.3 羰基还原酶基因的序列及二级结构分析 | 第31-34页 |
| 2.3.4 同源建模 | 第34-35页 |
| 2.3.5 CR工程菌的构建、表达 | 第35-39页 |
| 2.3.5.1 重组质粒酶切 | 第35-36页 |
| 2.3.5.2 SDS-PAGE | 第36页 |
| 2.3.5.3 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr产羰基还原酶活性 | 第36-37页 |
| 2.3.5.4 产物1,3-BDO的构型分析 | 第37-39页 |
| 2.4 本章小结 | 第39-40页 |
| 第三章 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr产酶条件优化 | 第40-50页 |
| 3.1 引言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.2.1 菌种 | 第40页 |
| 3.2.2 培养基 | 第40-41页 |
| 3.2.3 化学试剂与主要仪器 | 第41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-42页 |
| 3.3.1 菌体培养与收集 | 第41-42页 |
| 3.3.2 菌体密度OD_(600)与生物量的测定 | 第42页 |
| 3.3.3 酶活单位定义 | 第42页 |
| 3.3.4 酶活力测定方法 | 第42页 |
| 3.3.5 气相检测方法 | 第42页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第42-49页 |
| 3.4.1 重组菌生长过程曲线及种龄的确定 | 第43页 |
| 3.4.2 摇瓶发酵培养基及诱导条件优化 | 第43-49页 |
| 3.4.2.1 不同初始发酵培养基及诱导剂的选择 | 第43-44页 |
| 3.4.2.2 碳源浓度的优化 | 第44-45页 |
| 3.4.2.3 氮源浓度的优化 | 第45-47页 |
| 3.4.2.4 诱导剂浓度的优化 | 第47-48页 |
| 3.4.2.5 诱导温度的优化 | 第48页 |
| 3.4.2.6 诱导时间的优化 | 第48-49页 |
| 3.5 本章小结 | 第49-50页 |
| 第四章 重组羰基还原酶的酶学性质研究 | 第50-63页 |
| 4.1 引言 | 第50页 |
| 4.2 材料与方法 | 第50-52页 |
| 4.2.1 菌种及培养基 | 第50页 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 | 第50页 |
| 4.2.3 菌体与粗酶液的制备 | 第50-51页 |
| 4.2.4 分析方法 | 第51-52页 |
| 4.2.4.1 羰基还原酶活力测定方法 | 第51页 |
| 4.2.4.2 羰基还原酶活力定义 | 第51-52页 |
| 4.2.4.3 蛋白质含量的测定 | 第52页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第52-62页 |
| 4.3.1 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr羰基还原酶的辅酶依赖型 | 第52-53页 |
| 4.3.2 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr破碎条件的确定 | 第53-54页 |
| 4.3.3 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr羰基还原酶的最适反应温度与热稳定性 | 第54-56页 |
| 4.3.4 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr羰基还原酶的最适反应pH与pH稳定性 | 第56-57页 |
| 4.3.5 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr羰基还原酶底物特异性考察 | 第57-58页 |
| 4.3.6 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr羰基还原酶的动力学常数考察 | 第58-60页 |
| 4.3.7 化学试剂对E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr羰基还原酶的影响 | 第60-62页 |
| 4.4 结论 | 第62-63页 |
| 第五章 E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr全细胞不对称催化还原体系反应条件的研究 | 第63-70页 |
| 5.1 引言 | 第63页 |
| 5.2 材料与方法 | 第63-64页 |
| 5.2.1 菌种及培养基 | 第63页 |
| 5.2.2 培养基 | 第63页 |
| 5.2.3 培养方法 | 第63页 |
| 5.2.4 底物的转化率测定 | 第63-64页 |
| 5.2.5 气相色谱分析方法 | 第64页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第64-69页 |
| 5.3.1 反应体系温度的选择 | 第64-65页 |
| 5.3.2 反应体系pH的选择 | 第65-66页 |
| 5.3.3 不同辅底物对反应转化率的影响 | 第66页 |
| 5.3.4 辅助底物浓度对反应转化率的影响 | 第66-67页 |
| 5.3.5 底物浓度对反应转化率的影响 | 第67-68页 |
| 5.3.6 不对称还原反应进程 | 第68-69页 |
| 5.4 本章小结 | 第69-70页 |
| 第六章 结论与展望 | 第70-72页 |
| 6.1 结论 | 第70-71页 |
| 6.2 展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-78页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
