| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第10-21页 |
| 1.1 β-葡萄糖苷酶研究综述 | 第10-18页 |
| 1.1.1 β-葡萄糖苷酶的分类 | 第11-12页 |
| 1.1.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质 | 第12-13页 |
| 1.1.3 β-葡萄糖苷酶的结构及催化机理 | 第13-15页 |
| 1.1.4 β-葡萄糖苷酶的来源 | 第15-16页 |
| 1.1.5 β-葡萄糖苷酶的应用 | 第16-17页 |
| 1.1.6 β-葡萄糖苷酶的研究现状及发展趋势 | 第17-18页 |
| 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第18-19页 |
| 1.2.1 巴斯德毕赤酵母酵母系统的优点 | 第18页 |
| 1.2.2 影响外源基因在毕赤酵母系统中表达的因素 | 第18-19页 |
| 1.3 本研究的前期工作、研究目的及意义 | 第19页 |
| 1.4 本研究的技术路线 | 第19-21页 |
| 1.4.1 β-葡萄糖苷酶基因全长cDNA序列的扩增 | 第19-20页 |
| 1.4.2 β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第20-21页 |
| 2 实验材料 | 第21-27页 |
| 2.1 载体与菌株 | 第21-22页 |
| 2.2 培养基 | 第22-24页 |
| 2.2.1 米曲霉培养基 | 第22-23页 |
| 2.2.2 大肠杆菌培养基 | 第23页 |
| 2.2.3 酵母培养基 | 第23-24页 |
| 2.3 主要仪器 | 第24页 |
| 2.4 试剂及各种溶液的配制 | 第24-27页 |
| 2.4.1 分子生物学与化学试剂 | 第24-25页 |
| 2.4.2 常规溶液的配制 | 第25-27页 |
| 3 实验步骤 | 第27-39页 |
| 3.1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆 | 第27-30页 |
| 3.1.1 米曲霉gif-10 RNA的提取 | 第27页 |
| 3.1.2 米曲霉cDNA第一链的合成 | 第27-28页 |
| 3.1.3 β-葡萄糖苷酶基因的扩增 | 第28页 |
| 3.1.4 连接 | 第28-29页 |
| 3.1.5 转化 | 第29页 |
| 3.1.6 阳性克隆菌株的筛选及鉴定 | 第29-30页 |
| 3.2 β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达 | 第30-34页 |
| 3.2.1 含bgl基因质粒的提取 | 第30页 |
| 3.2.2 带酶切位点的bgl基因的扩增 | 第30页 |
| 3.2.3 表达载体的制备 | 第30-31页 |
| 3.2.4 酶切 | 第31页 |
| 3.2.5 连接、转化 | 第31-32页 |
| 3.2.6 阳性菌落的鉴定 | 第32页 |
| 3.2.7 毕赤酵母重组表达载体的电击转化 | 第32-33页 |
| 3.2.8 重组酵母菌株的鉴定 | 第33-34页 |
| 3.2.9 重组酵母菌株的筛选和诱导表达 | 第34页 |
| 3.2.10 重组酵母菌株的遗传稳定性分析 | 第34页 |
| 3.3 重组酵母工程菌株表达蛋白的分离纯化 | 第34-36页 |
| 3.3.1 硫酸铵沉淀 | 第34-35页 |
| 3.3.2 镍柱纯化 | 第35页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE | 第35-36页 |
| 3.4 β-葡萄糖苷酶酶活力测定及蛋白含量测定 | 第36-38页 |
| 3.4.1 β-葡萄糖苷酶酶活力测定 | 第36-37页 |
| 3.4.2 β-葡萄糖苷酶蛋白含量的测定 | 第37-38页 |
| 3.5 重组酵母工程菌表达蛋白酶学性质分析 | 第38-39页 |
| 3.5.1 酶最适温度的测定 | 第38页 |
| 3.5.2 酶热稳定性的测定 | 第38页 |
| 3.5.3 酶最适pH的测定 | 第38页 |
| 3.5.4 酶pH稳定性的测定 | 第38页 |
| 3.5.5 酶底物特异性分析 | 第38-39页 |
| 3.5.6 金属离子对酶活力的影响 | 第39页 |
| 4 结果与分析 | 第39-53页 |
| 4.1 β-葡萄糖苷酶基因bgl的克隆、cDNA测序和序列分析 | 第39-43页 |
| 4.1.1 米曲霉RNA的提取 | 第39页 |
| 4.1.2 β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列的扩增 | 第39-40页 |
| 4.1.3 β-葡萄糖苷酶基因序列分析 | 第40-42页 |
| 4.1.4 β-葡萄糖苷酶蛋白质序列分析 | 第42-43页 |
| 4.2 β-葡萄糖苷酶基因bgl在毕赤酵母中的表达 | 第43-47页 |
| 4.2.1 带酶切位点的bgl基因的扩增 | 第43页 |
| 4.2.2 DH5α-pPICZαA-bgl的构建 | 第43-44页 |
| 4.2.3 DH5α-pPICZαA-bgl的鉴定 | 第44页 |
| 4.2.4 重组质粒的电击转化及鉴定 | 第44-45页 |
| 4.2.5 转化子的筛选及酵母工程菌的表达 | 第45页 |
| 4.2.6 诱导时间对酶活的影响 | 第45-46页 |
| 4.2.7 酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第46-47页 |
| 4.3 β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质分析 | 第47-53页 |
| 4.3.1 β-葡萄糖苷酶的纯化 | 第47-48页 |
| 4.3.2 β-葡萄糖苷酶的酶活测定与蛋白含量测定 | 第48-49页 |
| 4.3.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质分析 | 第49-53页 |
| 5 讨论及结论 | 第53-56页 |
| 5.1 讨论 | 第53-55页 |
| 5.1.1 巴斯德毕赤酵母的优势 | 第53-54页 |
| 5.1.2 表达体系宿主菌与表达载体的选择 | 第54页 |
| 5.1.3 影响毕赤酵母重组表达β-葡萄糖苷酶的因素 | 第54-55页 |
| 5.2 结论 | 第55-56页 |
| 6 创新性及研究展望 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第62页 |
