| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第9-18页 |
| 1.1 纤维素酶研究综述 | 第9-15页 |
| 1.1.1 纤维素酶的结构 | 第9-11页 |
| 1.1.2 纤维素酶的来源 | 第11-12页 |
| 1.1.3 纤维素酶的应用 | 第12-15页 |
| 1.2 内切葡聚糖酶蛋白质工程的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.1 内切葡聚糖酶蛋白质工程的非合理设计 | 第15-16页 |
| 1.2.2 内切葡聚糖酶蛋白质工程的理性设计 | 第16-17页 |
| 1.3 本研究的前期工作基础及目的意义 | 第17-18页 |
| 1.3.1 本研究的前期工作基础 | 第17页 |
| 1.3.2 本研究的目的意义 | 第17-18页 |
| 2 材料 | 第18-23页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第18-19页 |
| 2.2 试剂与溶液 | 第19-22页 |
| 2.2.1 分子生物学与化学试剂 | 第19页 |
| 2.2.2 内切葡聚糖酶酶活性及蛋白质含量测定溶液 | 第19-21页 |
| 2.2.3 相关缓冲液的配制 | 第21-22页 |
| 2.3 培养基 | 第22-23页 |
| 2.4 主要仪器 | 第23页 |
| 3 实验方法 | 第23-33页 |
| 3.1 内切葡聚糖酶基因的定点突变 | 第23-27页 |
| 3.1.1 突变引物的设计 | 第23-24页 |
| 3.1.2 f-10质粒的提取 | 第24-25页 |
| 3.1.3 定点突变PCR | 第25页 |
| 3.1.4 突变质粒的转化 | 第25-26页 |
| 3.1.5 突变转化子鉴定 | 第26-27页 |
| 3.1.6 双酶切鉴定 | 第27页 |
| 3.1.7 DNA测序 | 第27页 |
| 3.2 突变内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第27-30页 |
| 3.2.1 突变质粒的提取 | 第27页 |
| 3.2.2 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备 | 第27-28页 |
| 3.2.3 转化 | 第28页 |
| 3.2.4 阳性菌落鉴定 | 第28页 |
| 3.2.5 双酶切鉴定 | 第28页 |
| 3.2.6 诱导表达 | 第28页 |
| 3.2.7 内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达检测 | 第28-29页 |
| 3.2.8 蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第29页 |
| 3.2.9 大肠杆菌细胞的破碎与粗酶液的制备 | 第29-30页 |
| 3.3 内切葡聚糖酶的分离纯化 | 第30-31页 |
| 3.3.1 结合缓冲液和洗脱缓冲液的咪唑浓度确定 | 第30页 |
| 3.3.2 内切葡聚糖酶纯化 | 第30-31页 |
| 3.4 内切葡聚糖酶的酶活测定方法 | 第31-32页 |
| 3.4.1 纤维素酶活力的定义 | 第31页 |
| 3.4.2 DNS法测酶活的原理 | 第31页 |
| 3.4.3 葡萄糖标准曲线的制作 | 第31页 |
| 3.4.5 内切葡聚糖酶酶活力的测定方法 | 第31-32页 |
| 3.4.6 蛋白质标准曲线的制备 | 第32页 |
| 3.4.7 测定蛋白质含量 | 第32页 |
| 3.5 内切葡聚糖酶酶学性质分析 | 第32-33页 |
| 3.5.1 最适反应温度 | 第32-33页 |
| 3.5.2 最适pH的测定 | 第33页 |
| 3.5.3 酶的热稳定性 | 第33页 |
| 3.5.4 金属离子对酶的影响 | 第33页 |
| 4 结果与分析 | 第33-45页 |
| 4.1 内切葡聚糖酶基因的定点突变 | 第33-35页 |
| 4.2 突变内切葡聚糖酶基因的序列测定 | 第35-37页 |
| 4.3 突变内切葡聚糖酶的表达与纯化 | 第37-38页 |
| 4.4 内切葡聚糖酶酶活力的测定 | 第38-40页 |
| 4.4.1 葡萄糖标准曲线的制备 | 第38-39页 |
| 4.4.2 蛋白质标准曲线的制备 | 第39页 |
| 4.4.3 内切葡聚糖酶酶活力的计算 | 第39-40页 |
| 4.5 突变内切葡聚糖酶酶学性质的测定 | 第40-43页 |
| 4.5.1 酶促反应的最适pH | 第40-41页 |
| 4.5.2 酶促反应的最适温度 | 第41页 |
| 4.5.3 酶促反应的热稳定性 | 第41-42页 |
| 4.5.4 金属离子对酶活的影响 | 第42-43页 |
| 4.6 突变内切葡聚糖酶的结构分析 | 第43-45页 |
| 4.6.1 突变内切葡聚糖酶的二级结构预测 | 第43页 |
| 4.6.2 突变内切葡聚糖酶成熟蛋白的三维结构预测分析 | 第43-44页 |
| 4.6.3 突变内切葡聚糖酶局部三维结构预测分析 | 第44-45页 |
| 5 讨论 | 第45-48页 |
| 5.1 大肠杆菌表达系统的优点 | 第45-46页 |
| 5.2 纤维素酶的三维结构分析 | 第46页 |
| 5.3 突变位点的分析 | 第46-48页 |
| 结论 | 第48-49页 |
| 创新点 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-55页 |
| 致谢 | 第55页 |
