| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第1章 序言 | 第12-20页 |
| 一. 血吸虫病：仅次于疟疾的世界第二大寄生虫疾病 | 第12-16页 |
| 1. 血吸虫病病原的形态特征和生活史 | 第12-13页 |
| 2. 人类血吸虫病的主要病原种类及分布 | 第13-14页 |
| 3. 血吸虫病的症状 | 第14-15页 |
| 4. 三种主要人类血吸虫病病原的基因组、转录组学研究进展 | 第15-16页 |
| 二. RNA干扰(RNAi)：双链RNA(dsRNA)引发的基因沉默现象 | 第16-17页 |
| 三. miRNA：起源于茎环结构转录本的内源性非编码RNA | 第17-20页 |
| 第2章 日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)基因的RNA干扰 | 第20-43页 |
| 一. 研究背景与技术路线 | 第20-24页 |
| 1. 研究背景 | 第20-22页 |
| 1.1 RNAi技术在血吸虫功能基因组学研究中的应用 | 第20-22页 |
| 1.2 日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)的研究进展 | 第22页 |
| 2. 技术路线 | 第22-24页 |
| 二. 实验材料与仪器 | 第24-27页 |
| 1. 实验材料 | 第24-25页 |
| 1.1 培养基与电转缓冲液 | 第24页 |
| 1.2 引物 | 第24页 |
| 1.3 siRNAs | 第24-25页 |
| 1.4 实验动物 | 第25页 |
| 1.5 血清 | 第25页 |
| 1.6 其他试剂与耗材 | 第25页 |
| 2. 主要实验仪器 | 第25-27页 |
| 三. 实验方法 | 第27-34页 |
| 1. 电转法进行SjAR基因的RNAi | 第27-31页 |
| 1.1 使用日本血吸虫尾蚴感染昆明鼠 | 第27页 |
| 1.2 灌注小鼠肝门静脉进行血吸虫虫体采集 | 第27-28页 |
| 1.3 使用电转法对感染后14天童虫进行RNAi操作 | 第28页 |
| 1.4 血吸虫全RNA的小量提取 | 第28-29页 |
| 1.5 血吸虫cDNA的制备 | 第29-30页 |
| 1.6 cDNA中的基因组DNA(gDNA)污染情况检测 | 第30页 |
| 1.7 cDNA完整性检测 | 第30页 |
| 1.8 实时定量检测RNAi处理组与对照组SjAR基因转录水平差异 | 第30-31页 |
| 2. 浸泡法进行SjAR基因的RNAi | 第31-34页 |
| 2.1 使用日本血吸虫尾蚴感染昆明鼠 | 第31页 |
| 2.2 灌注小鼠肝门静脉进行血吸虫虫体采集 | 第31页 |
| 2.3 使用浸泡法对感染后14天童虫进行RNAi操作 | 第31-32页 |
| 2.4 血吸虫全RNA的小量提取 | 第32页 |
| 2.5 从Trizol法提取血吸虫RNA的剩余样品中提取血吸虫蛋白 | 第32页 |
| 2.6 血吸虫cDNA的制备 | 第32-33页 |
| 2.7 实时定量检测RNAi处理组与对照组SjAR基因转录水平差异 | 第33页 |
| 2.8 Western杂交检测RNAi处理组与对照组SjAR基因在蛋白水平上的表达差异 | 第33-34页 |
| 四. 实验结果 | 第34-41页 |
| 1. 电转法进行SjAR基因的RNAi | 第34-37页 |
| 1.1 电转法RNAi处理的分组情况和虫体RNA提取结果 | 第34页 |
| 1.2 cDNA的完整性和gDNA污染情况检测 | 第34-35页 |
| 1.3 荧光定量PCR检测电转法RNAi处理在SjAR基因转录水平上的效果 | 第35-37页 |
| 1.4 小结 | 第37页 |
| 2. 浸泡法进行SjAR基因的RNAi | 第37-41页 |
| 2.1 浸泡法RNAi实验的分组情况和虫体RNA提取结果 | 第37-38页 |
| 2.2 荧光定量PCR检测浸泡法RNAi处理在SjAR基因转录水平上的效果 | 第38-39页 |
| 2.3 Western杂交检测浸泡法RNAi处理在SjAR蛋白水平上的效果 | 第39-40页 |
| 2.4 小结 | 第40-41页 |
| 五. 分析与展望 | 第41-43页 |
| 第3章 血吸虫miRNAs海绵技术的开发 | 第43-83页 |
| 一. 研究背景与技术路线 | 第43-50页 |
| 1. 研究背景 | 第43-48页 |
| 1.1 血吸虫内源小型非编码RNA(sncRNA)的组学研究进展 | 第43页 |
| 1.2 miRNA海绵技术：竞争性地抑制miRNA调控功能 | 第43-45页 |
| 1.3 血吸虫外源基因转化、转染技术的研究进展 | 第45-48页 |
| 2. 技术路线 | 第48-50页 |
| 二. 实验材料与仪器 | 第50-53页 |
| 1. 实验材料 | 第50-52页 |
| 1.1 培养基、缓冲液与洗液 | 第50页 |
| 1.2 引物 | 第50-51页 |
| 1.3 质粒与菌株 | 第51页 |
| 1.4 实验动物 | 第51页 |
| 1.5 其他试剂与耗材 | 第51-52页 |
| 2. 主要实验仪器 | 第52-53页 |
| 三. 实验方法 | 第53-67页 |
| 1. 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒的构建 | 第53-56页 |
| 1.1 原始质粒的大量制备及保种 | 第53页 |
| 1.2 pFB-CMV-Cherry质粒的构建、保种与大量制备 | 第53-55页 |
| 1.3 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的构建 | 第55-56页 |
| 2. 荧光蛋白表达质粒的转化与虫体发光情况观察 | 第56-58页 |
| 2.1 使用电转法向日本血吸虫童虫、成虫中转化荧光蛋白表达质粒 | 第56-57页 |
| 2.2 荧光显微镜下观察虫体发光情况 | 第57-58页 |
| 3. 以萤火虫荧光素酶为报告基因的血吸虫miR-71海绵表达质粒的构建 | 第58-61页 |
| 3.1 靶向血吸虫miR-71的miRNA海绵序列设计与化学合成 | 第58页 |
| 3.2 pGL3-Basic-Sponge质粒的构建 | 第58-60页 |
| 3.3 pJC1-Sponge质粒的构建与大量制备 | 第60-61页 |
| 4. 血吸虫miR-71海绵表达构件的电转化与效果评定 | 第61-67页 |
| 4.1 曼氏血吸虫尾蚴的释放与收集 | 第61-62页 |
| 4.2 使用双头注射器进行曼氏血吸虫尾蚴去尾转化 | 第62-64页 |
| 4.3 miR-71海绵的体外转录 | 第64页 |
| 4.4 使用电转法向去尾转化的童虫体内导入海绵表达构件(质粒DNA或体外转录的mRNA) | 第64-65页 |
| 4.5 虫体裂解液荧光素酶酶活的测定 | 第65-66页 |
| 4.6 感染后14天日本血吸虫童虫电转转化效率的检测 | 第66-67页 |
| 四. 实验结果 | 第67-81页 |
| 1. 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒的构建 | 第67-70页 |
| 1.1 原始质粒的大量制备及保种 | 第67页 |
| 1.2 pFB-CMV-Cherry质粒的构建、保种与大量制备 | 第67-68页 |
| 1.3 SjAct基因启动子序列转录因子结合位点分析 | 第68-69页 |
| 1.4 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的构建 | 第69-70页 |
| 1.5 小结 | 第70页 |
| 2. 荧光蛋白表达质粒的转化与虫体发光情况观察 | 第70-72页 |
| 2.1 荧光显微镜观察结果 | 第70-72页 |
| 2.2 小结 | 第72页 |
| 3. 以萤火虫荧光素酶为报告基因的血吸虫miR-71海绵表达质粒的构建 | 第72-76页 |
| 3.1 日本、曼氏血吸虫miR-71序列的查找以及miR-71海绵序列的设计与化学合成 | 第72-73页 |
| 3.2 pGL3-Basic-Sponge质粒的构建 | 第73-74页 |
| 3.3 pJC1-Sponge质粒的构建 | 第74-75页 |
| 3.4 小结 | 第75-76页 |
| 4. 血吸虫miR-71海绵表达构件的电转化与效果评定 | 第76-81页 |
| 4.1 曼氏血吸虫尾蚴的释放、收集与去尾转化 | 第76页 |
| 4.2 mLuc与mLuc+Sponge两种mRNA的体外转录 | 第76-77页 |
| 4.3 海绵mRNA的电转化以及虫体匀浆荧光素酶活力测定 | 第77-78页 |
| 4.4 海绵质粒DNA的电转化以及虫体匀浆荧光素酶活力的测定 | 第78-79页 |
| 4.5 感染后14天的日本血吸虫电转转化效率的检测 | 第79-80页 |
| 4.6 小结 | 第80-81页 |
| 五. 分析与展望 | 第81-83页 |
| 第4章 日本血吸虫miR-71的靶基因预测与批量表达 | 第83-101页 |
| 一. 研究背景与技术路线 | 第83-85页 |
| 1. 研究背景 | 第83-84页 |
| 1.1 血吸虫及其它生物体中miR-71家族的研究进展 | 第83-84页 |
| 2. 技术路线 | 第84-85页 |
| 二. 实验材料与仪器 | 第85-88页 |
| 1. 实验材料 | 第85-86页 |
| 1.1 培养基 | 第85页 |
| 1.2 引物 | 第85页 |
| 1.3 质粒和菌株 | 第85页 |
| 1.4 血清 | 第85-86页 |
| 1.5 纯化介质和预装柱 | 第86页 |
| 1.6 蛋白凝胶染色液与脱色液 | 第86页 |
| 1.7 包涵体蛋白过柱纯化过程的相关试剂 | 第86页 |
| 1.8 其它试剂与耗材 | 第86页 |
| 2. 主要实验仪器 | 第86-88页 |
| 三. 实验方法 | 第88-94页 |
| 1. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的预测 | 第88页 |
| 2. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的批量表达与纯化 | 第88-92页 |
| 2.1 五个基因表达质粒的构建 | 第88-90页 |
| 2.2 对表达质粒构建成功的靶基因进行小量诱导表达 | 第90页 |
| 2.3 可诱导的蛋白的大量制备 | 第90-91页 |
| 2.4 包涵体蛋白的变性和过柱纯化 | 第91-92页 |
| 3. 重组蛋白兔多克隆抗体的制备及滴度评价 | 第92-94页 |
| 3.1 兔多克隆抗体的制备 | 第92页 |
| 3.2 间接ELISA法评价多克隆抗体滴度 | 第92-94页 |
| 四. 实验结果 | 第94-99页 |
| 1. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的预测 | 第94-95页 |
| 2. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的批量表达与纯化 | 第95-97页 |
| 2.1 五个基因表达质粒的构建 | 第95页 |
| 2.2 对表达质粒构建成功的靶基因进行小量诱导表达 | 第95-96页 |
| 2.3 可诱导的蛋白的大量制备 | 第96-97页 |
| 2.4 包涵体蛋白的变性和过柱纯化 | 第97页 |
| 2.5 小结 | 第97页 |
| 3. 重组蛋白兔多克隆抗体的制备及滴度评价 | 第97-99页 |
| 五. 分析与展望 | 第99-101页 |
| 本研究的意义和创新点 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
