| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.1 D-泛酸 | 第14-16页 |
| 1.1.1 D-泛酸的简介 | 第14-15页 |
| 1.1.2 D-泛酸的合成 | 第15-16页 |
| 1.1.2.1 生物代谢合成 | 第15页 |
| 1.1.2.2 化学法合成 | 第15-16页 |
| 1.2 D-泛酸前体的合成 | 第16-22页 |
| 1.2.1 β-丙氨酸的酶法合成 | 第16-17页 |
| 1.2.2 酮泛解酸内酯的化学合成 | 第17页 |
| 1.2.3 D-泛解酸内酯的合成 | 第17-22页 |
| 1.2.3.1 重金属催化剂合成D-泛解酸内酯 | 第18页 |
| 1.2.3.2 生物酶法合成D-泛解酸内酯 | 第18-21页 |
| 1.2.3.2.1 水解酶拆分法 | 第18-19页 |
| 1.2.3.2.2 氧化还原酶法 | 第19-21页 |
| 1.2.3.3 化学酶法合成D-泛解酸内酯 | 第21-22页 |
| 1.3 酮泛解酸内酯还原酶 | 第22-24页 |
| 1.3.1 酮泛解酸内酯的简介 | 第22页 |
| 1.3.2 酮泛解酸内酯还原酶 | 第22-23页 |
| 1.3.3 酮泛解酸还原酶 | 第23-24页 |
| 1.4 本论文研究背景、内容及意义 | 第24-26页 |
| 1.4.1 研究背景与意义 | 第24-25页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第25页 |
| 1.4.3 研究目标 | 第25-26页 |
| 第二章 酮泛解酸内酯还原酶的克隆、表达与纯化 | 第26-49页 |
| 2.1 引言 | 第26-27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-29页 |
| 2.2.1 菌种及质粒载体 | 第27页 |
| 2.2.2 试剂与材料 | 第27页 |
| 2.2.3 培养基与缓冲液 | 第27-28页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-35页 |
| 2.3.1 菌种的活化与种子液培养 | 第29页 |
| 2.3.2 引物设计 | 第29页 |
| 2.3.3 BL21 (DE3)/pEASY Blunt E1-SceCPR1基因工程菌的构建 | 第29-31页 |
| 2.3.3.1 目的基因的扩增 | 第29-30页 |
| 2.3.3.2 重组质粒pEASY-Blunt E1-SceCPR1的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.3.3 重组质粒pEASY-Blunt E1-SceCPR1的表达 | 第31页 |
| 2.3.4 密码子优化并转化E. coli BL21 (DE3) | 第31-32页 |
| 2.3.5 BL21 (DE3)/pACYCDuet 1-SceCPR1/EsGDH工程菌的构建 | 第32-33页 |
| 2.3.5.1 质粒的双酶切与胶回收 | 第32页 |
| 2.3.5.2 pACYCDuet 1-SceCPR1/EsGDH重组质粒的构建与克隆 | 第32-33页 |
| 2.3.5.3 双基因共表达重组菌的构建与诱导表达 | 第33页 |
| 2.3.6 BL21 (DE3)/pACYCDuet 1-SceCPR1/EsGDH诱导条件优化 | 第33-35页 |
| 2.3.6.1 标准诱导表达体系 | 第33-34页 |
| 2.3.6.2 SceCPR1和EsGDH酶活的测定 | 第34页 |
| 2.3.6.3 诱导温度的优化 | 第34页 |
| 2.3.6.4 诱导剂IPTG添加量的优化 | 第34页 |
| 2.3.6.5 诱导时间的优化 | 第34-35页 |
| 2.3.7 SceCPR1目的蛋白的分离、纯化 | 第35页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第35-48页 |
| 2.4.1 基因组的提取以及目的基因的扩增 | 第35-37页 |
| 2.4.2 阳性克隆子的筛选与测序鉴定 | 第37-38页 |
| 2.4.3 重组质粒pEASY Blunt E1-SceCPR1的表达 | 第38-39页 |
| 2.4.4 密码子优化、转化与阳性克隆子的诱导表达 | 第39-40页 |
| 2.4.5 质粒的双酶切与胶回收 | 第40-41页 |
| 2.4.6 pACYCDuet 1-SceCPR1/Es GDH重组质粒的构建与鉴定 | 第41-43页 |
| 2.4.7 pACYCDuet 1-SceCPR1/Es GDH转化BL21 (DE3)及诱导表达 | 第43页 |
| 2.4.8 诱导温度的优化 | 第43-44页 |
| 2.4.9 诱导剂添加量的优化 | 第44-45页 |
| 2.4.10 诱导时长的优化 | 第45-46页 |
| 2.4.11 目的蛋白的分离和纯化 | 第46-48页 |
| 2.5 本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 酮泛解酸内酯还原酶的酶学性质研究 | 第49-64页 |
| 3.1 引言 | 第49页 |
| 3.2 实验材料 | 第49-51页 |
| 3.2.1 SceCPR1纯酶的获取 | 第49-50页 |
| 3.2.2 试剂与材料 | 第50页 |
| 3.2.3 缓冲液 | 第50页 |
| 3.2.4 主要仪器 | 第50-51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-55页 |
| 3.3.1 蛋白质浓度标准曲线制作及目的蛋白浓度检测 | 第51页 |
| 3.3.2 标准酶活检测 | 第51-52页 |
| 3.3.3 pH对SceCPR1酶活的影响 | 第52页 |
| 3.3.4 温度对SceCPR1酶活的影响 | 第52页 |
| 3.3.5 SceCPR1酶的温度稳定性 | 第52-53页 |
| 3.3.6 金属离子以及EDTA对SceCPR1酶活的影响 | 第53页 |
| 3.3.7 有机溶剂对SceCPR1酶活的影响 | 第53页 |
| 3.3.8 SceCPR1酶的底物谱 | 第53-54页 |
| 3.3.9 SceCPR1酶的动力学常数 | 第54-55页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第55-63页 |
| 3.4.1 蛋白质浓度标准曲线及目的蛋白浓度检测 | 第55页 |
| 3.4.2 pH对SceCPR1酶活的影响 | 第55-56页 |
| 3.4.3 温度对SceCPR1酶活的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.4 SceCPR1酶的温度稳定性 | 第57-58页 |
| 3.4.5 金属离子以及EDTA对SceCPR1酶活的影响 | 第58-59页 |
| 3.4.6 有机溶剂对SceCPR1酶活的影响 | 第59页 |
| 3.4.7 SceCPR1酶的底物谱 | 第59-61页 |
| 3.4.8 SceCPR1酶的动力学常数 | 第61-63页 |
| 3.5 本章小结 | 第63-64页 |
| 第四章 全细胞高效不对称合成D-泛解酸内酯的研究 | 第64-89页 |
| 4.1 引言 | 第64-65页 |
| 4.2 实验材料 | 第65-67页 |
| 4.2.1 菌种 | 第65页 |
| 4.2.2 试剂 | 第65页 |
| 4.2.3 培养基与缓冲液 | 第65-66页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第66-67页 |
| 4.3 实验方法 | 第67-72页 |
| 4.3.1 工程菌的发酵培养 | 第67页 |
| 4.3.1.1 菌种的活化 | 第67页 |
| 4.3.1.2 种子液发酵罐发酵培养 | 第67页 |
| 4.3.1.3 冻干菌粉的制备 | 第67页 |
| 4.3.2 气相色谱方法及各物质标准曲线的制备 | 第67-68页 |
| 4.3.3 全细胞催化体系的条件优化 | 第68-71页 |
| 4.3.3.1 底物的化学内酯化、底物水解率及产物得率的计算 | 第68-69页 |
| 4.3.3.2 全细胞催化标准体系 | 第69页 |
| 4.3.3.3 全细胞催化体系的最适pH | 第69页 |
| 4.3.3.4 全细胞催化体系的最适温度 | 第69页 |
| 4.3.3.5 全细胞催化体系的最适生物催化剂（干菌粉）添加量 | 第69页 |
| 4.3.3.6 全细胞催化体系的最适辅酶添加量 | 第69-70页 |
| 4.3.3.7 全细胞催化体系的最适辅底物添加量 | 第70页 |
| 4.3.3.8 全细胞催化体系的最适搅拌速度 | 第70页 |
| 4.3.3.9 全细胞催化体系的最适底物浓度 | 第70-71页 |
| 4.3.4 KPL和D-PL自发水解过程的监测 | 第71页 |
| 4.3.5 持续流加工艺的应用探究与优化 | 第71-72页 |
| 4.3.5.1 持续流加工艺对全细胞催化的影响 | 第71-72页 |
| 4.3.5.2 储液pH对全细胞催化的影响 | 第72页 |
| 4.3.5.3 产物的初步提取与鉴定 | 第72页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第72-88页 |
| 4.4.1 冻干菌粉的除水率计算 | 第72-73页 |
| 4.4.2 各物质的气相色谱图及标准曲线绘制 | 第73-75页 |
| 4.4.3 全细胞催化体系的最适pH | 第75-76页 |
| 4.4.4 全细胞催化体系的最适温度 | 第76-77页 |
| 4.4.5 全细胞催化体系的生物催化剂最适添加量 | 第77-78页 |
| 4.4.6 全细胞催化体系的最适辅酶添加量 | 第78页 |
| 4.4.7 全细胞催化体系的最适辅底物添加量 | 第78-79页 |
| 4.4.8 全细胞催化体系的最适转速 | 第79-80页 |
| 4.4.9 全细胞催化体系的最适底物浓度 | 第80-81页 |
| 4.4.10 KPL和D-PL自发水解过程的监测 | 第81-82页 |
| 4.4.11 持续流加补料工艺的建立对全细胞催化的影响 | 第82-83页 |
| 4.4.12 降低储液pH对持续流加补料工艺的影响 | 第83-84页 |
| 4.4.13 反应液中的产物的提纯与鉴定 | 第84-88页 |
| 4.5 本章小结 | 第88-89页 |
| 第五章 结论与展望 | 第89-91页 |
| 5.1 结论 | 第89-90页 |
| 5.2 展望 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第100页 |
