| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略词表 | 第15-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-46页 |
| 1.1 p53的结构和修饰 | 第21-25页 |
| 1.2 p53的功能与调控 | 第25-26页 |
| 1.3 p53异构体△113p53/△133p53 | 第26-31页 |
| 1.4 p53蛋白家族 | 第31-34页 |
| 1.5 模式动物斑马鱼研究概述 | 第34-37页 |
| 1.5.1 斑马鱼的研究优势 | 第34-35页 |
| 1.5.2 斑马鱼的研究应用 | 第35-37页 |
| 1.6 蛋白质DNA相互作用研究方法概述 | 第37-44页 |
| 1.6.1 DNA足迹法(DNA footprinting) | 第38-39页 |
| 1.6.2 电泳迁移率变动分析(electrophoresis mobility shift assay,EMSA) | 第39-41页 |
| 1.6.3 染色体免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP) | 第41-43页 |
| 1.6.4 其他蛋白DNA结合研究方法 | 第43-44页 |
| 1.7 本课题研究的目的、内容和意义 | 第44-46页 |
| 第二章 材料与方法 | 第46-74页 |
| 2.1 斑马鱼相关实验和饲养 | 第46-48页 |
| 2.1.1 斑马鱼饲养及品系 | 第46页 |
| 2.1.2 斑马鱼的交配及受精卵的收集 | 第46页 |
| 2.1.3 显微注射实验(microinjection) | 第46-48页 |
| 2.1.4 斑马鱼胚胎存活率分析 | 第48页 |
| 2.2 人类细胞系的培养和转染 | 第48-49页 |
| 2.2.1 细胞系的培养、传代 | 第48页 |
| 2.2.2 细胞转染 | 第48页 |
| 2.2.3 细胞冻存 | 第48-49页 |
| 2.3 DNA相关操作方法 | 第49-54页 |
| 2.3.1 DNA片段克隆 | 第49-51页 |
| 2.3.2 DNA测序反应 | 第51页 |
| 2.3.3 质粒的提取 | 第51-52页 |
| 2.3.4 斑马鱼基因组DNA提取 | 第52-53页 |
| 2.3.5 基因组DNA的超声片段化 | 第53-54页 |
| 2.3.6 酚氯仿抽提和酒精沉淀法提取纯化DNA | 第54页 |
| 2.3.7 斑马鱼细胞凋亡检测 | 第54页 |
| 2.4 RNA相关操作方法 | 第54-58页 |
| 2.4.1 总RNA样品的提取 | 第54-55页 |
| 2.4.2 DNase Ⅰ处理总RNA样品 | 第55页 |
| 2.4.3 反转录合成cDNA | 第55-56页 |
| 2.4.4 实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR) | 第56页 |
| 2.4.5 mRNA的体外合成 | 第56页 |
| 2.4.6 Northern印记分析 | 第56-58页 |
| 2.5 蛋白质和抗体相关操作方法 | 第58-66页 |
| 2.5.1 蛋白样品的提取 | 第58-59页 |
| 2.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第59-60页 |
| 2.5.3 考马斯亮蓝染色和脱色 | 第60页 |
| 2.5.4 蛋白免疫印迹(Western blot) | 第60-62页 |
| 2.5.5 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation) | 第62页 |
| 2.5.6 染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation) | 第62-64页 |
| 2.5.7 蛋白免疫荧光实验 | 第64页 |
| 2.5.8 大肠杆菌表达纯化蛋白 | 第64-66页 |
| 2.8 本文所用化学试剂及相关溶液配方 | 第66-69页 |
| 2.8.1 常用化学试剂及培养基 | 第66-68页 |
| 2.8.2 体外染色体免疫共沉淀所用溶液配方 | 第68-69页 |
| 2.8.3 不同浓度聚丙烯酰胺配方 | 第69页 |
| 2.9 本文所用主要引物列表 | 第69-73页 |
| 2.9.1 斑马鱼 | 第69-72页 |
| 2.9.2 人类细胞系 | 第72-73页 |
| 2.10 本文所用主要Morpholino列表 | 第73-74页 |
| 第三章 △113p53与P53的蛋白互作对于△113p53的凋亡拮抗功能必不可少 | 第74-83页 |
| 3.1 △113p53可与p53结合形成内源性蛋白复合物 | 第74-75页 |
| 3.2 寡聚化区域两个点突变破坏△113p53与全长p53蛋白复合物的形成 | 第75-77页 |
| 3.3 △113p53的两个突变消除了其对p53下游基因的调控 | 第77-78页 |
| 3.4 △113p53与p53互作的干扰损害其凋亡拮抗能力 | 第78-81页 |
| 3.5 HA-p53两个寡聚化突变体不影响自身蛋白稳定性但减弱了其功能性 | 第81-82页 |
| 3.6 小结与讨论 | 第82-83页 |
| 第四章 △133p53在细胞系中拮抗p53对三个代谢相关基因的转录激活作用 | 第83-88页 |
| 4.1 检测体系和最佳时间点的确立 | 第84-85页 |
| 4.2 △133p53显著减弱p53对GIs2、TIGAR和Sesn1三个基因的转录激活作用 | 第85-86页 |
| 4.3 小结和讨论 | 第86-88页 |
| 第五章 △113p53/△133p53促进DNA双链损伤修复以保护细胞免于死亡和衰老 | 第88-95页 |
| 5.1 斑马鱼△113p53能被γ-射线诱导大量表达,而紫外线和热激处理不行 | 第88-89页 |
| 5.2 斑马鱼△113p53蛋白也可被DNA双链损伤修复信号诱导表达 | 第89-90页 |
| 5.3 △113p53可不依赖于p53单独促进斑马鱼Rad51转录和蛋白水平的表达 | 第90-91页 |
| 5.4 在斑马鱼中封闭△113p53的表达会同时降低rad51的蛋白和转录水平表达 | 第91-92页 |
| 5.5 △113p53可结合到rad51、lig4和rad52启动子新的p53反应元件上 | 第92-93页 |
| 5.6 小结和讨论 | 第93-95页 |
| 第六章 斑马鱼p53蛋白与基因组DNA体外染色体免疫共沉淀技术的构建 | 第95-112页 |
| 6.1 大肠杆菌表达纯化HA-p53蛋白 | 第95-99页 |
| 6.1.1 表达载体的构建和蛋白表达测试 | 第95-96页 |
| 6.1.2 斑马鱼HA-p53蛋白表达纯化 | 第96-98页 |
| 6.1.3 大肠杆菌表达纯化HA-p53蛋白的鉴定 | 第98-99页 |
| 6.1.4 本部分小结 | 第99页 |
| 6.2 HA-p53纯化蛋白体外特异性结合质粒DNA的条件 | 第99-104页 |
| 6.2.1 本节实验材料和参数说明 | 第99-100页 |
| 6.2.2 ZnCl_2浓度梯度测试(50μM浓度效果较好) | 第100页 |
| 6.2.3 EDTA浓度梯度测试(0.2mM浓度效果最佳) | 第100-101页 |
| 6.2.4 ATP/ATP regenerative system测试(加ATP效果较好) | 第101-102页 |
| 6.2.5 温度测试反应(室温16-20度反应最佳) | 第102-103页 |
| 6.2.6 蛋白DNA比例测试(1μg protein-200ng DNA最好) | 第103页 |
| 6.2.7 其他一些测试结果 | 第103-104页 |
| 6.2.8 小结和讨论 | 第104页 |
| 6.3 体外染色体免疫共沉淀方法的最终确立 | 第104-109页 |
| 6.3.1 实验材料准备 | 第104-105页 |
| 6.3.2 体外染色体免疫共沉淀 | 第105-107页 |
| 6.3.3 qPCR验证DNA富集情况 | 第107-108页 |
| 6.3.3.1 检测结果 | 第107-108页 |
| 6.3.4 小结与讨论 | 第108-109页 |
| 6.4 In vitro ChIP-seq高通量测序初步结果 | 第109-112页 |
| 6.4.1 测序数据产出 | 第109-110页 |
| 6.4.2 与参考序列比对和累积深度 | 第110页 |
| 6.4.3 Peak注释 | 第110-111页 |
| 6.4.4 小结与讨论 | 第111-112页 |
| 第七章 总结与讨论 | 第112-120页 |
| 7.1 结论 | 第112-114页 |
| 7.2 讨论 | 第114-120页 |
| 7.2.1 功能机制研究部分 | 第114-118页 |
| 7.2.2 体外染色体免疫共沉淀技术构建部分 | 第118-120页 |
| 参考文献 | 第120-136页 |
| 作者简介 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
