| 符号说明 | 第5-9页 |
| 中文摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第15-35页 |
| 1.1 G蛋白偶联受体 | 第15-22页 |
| 1.1.1 G蛋白偶联受体的结构 | 第15-16页 |
| 1.1.2 G蛋白偶联受体的类型 | 第16页 |
| 1.1.3 G蛋白偶联受体的信号转导途径 | 第16-19页 |
| 1.1.4 G蛋白偶联受体的二聚化 | 第19-22页 |
| 1.2 Dynorphin/KOR系统及其功能 | 第22-28页 |
| 1.2.1 强啡肽 | 第22-23页 |
| 1.2.2 κ 阿片受体 | 第23-24页 |
| 1.2.3 Dynorphin/KOR系统的信号转导途径 | 第24-26页 |
| 1.2.4 Dynorphin/KOR系统的功能 | 第26-28页 |
| 1.2.4.1 参与药物成瘾调节 | 第26页 |
| 1.2.4.2 参与痛觉调制 | 第26-27页 |
| 1.2.4.3 参与神经保护 | 第27页 |
| 1.2.4.4 参与精神疾病的发生和发展 | 第27-28页 |
| 1.2.5 Dynorphin/KOR系统的研究进展 | 第28页 |
| 1.3 缓激肽受体家族及其病理生理学作用 | 第28-32页 |
| 1.3.1 缓激肽及其受体 | 第28-29页 |
| 1.3.2 Bradykinin/B2R系统的功能 | 第29-31页 |
| 1.3.2.1 参与心血管功能调节 | 第29-30页 |
| 1.3.2.2 参与炎症反应 | 第30页 |
| 1.3.2.3 参与神经保护 | 第30-31页 |
| 1.3.3 Bradykinin/B2R系统的信号转导途径 | 第31-32页 |
| 1.4 强啡肽/KOR系统和缓激肽/B2R系统的相关性 | 第32-33页 |
| 1.5 课题的设计思路及目的意义 | 第33-35页 |
| 2 材料与方法 | 第35-58页 |
| 2.1 材料 | 第35-40页 |
| 2.1.1 细胞和菌株 | 第35页 |
| 2.1.2 质粒与载体 | 第35页 |
| 2.1.3 抗体 | 第35页 |
| 2.1.4 细胞与分子实验试剂 | 第35-38页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第38-40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-58页 |
| 2.2.1 表达载体的构建 | 第40-42页 |
| 2.2.1.1 pcDNA3.1-KOR-Rluc重组质粒的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.1.2 B2R-mVenus重组质粒的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.2 细胞培养 | 第42-44页 |
| 2.2.2.1 细胞的复苏 | 第42页 |
| 2.2.2.2 细胞的传代 | 第42-43页 |
| 2.2.2.3 细胞的冻存 | 第43页 |
| 2.2.2.4 细胞的转染 | 第43-44页 |
| 2.2.2.5 稳定转染细胞株的筛选 | 第44页 |
| 2.2.3 RT-PCR检测基因表达 | 第44-45页 |
| 2.2.3.1 目的基因KOR和B2R引物设计 | 第44页 |
| 2.2.3.2 总RNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.2.3.3 总RNA纯度及完整性的检测 | 第45页 |
| 2.2.4 激光共聚焦扫描显微镜检测受体KOR和B2R的共定位 | 第45-46页 |
| 2.2.5 生物发光共振能量转移检测KOR和B2R间的相互作用 | 第46-47页 |
| 2.2.6 荧光共振能量转移检测KOR和B2R间的相互作用 | 第47-48页 |
| 2.2.7 邻位连接分析技术检测KOR和B2R间的相互作用 | 第48-50页 |
| 2.2.8 cAMP的检测 | 第50-51页 |
| 2.2.9 G蛋白结合分析 | 第51页 |
| 2.2.10 双报告基因检测分析 | 第51-54页 |
| 2.2.11 Western blot检测CREB磷酸化 | 第54-56页 |
| 2.2.12 SH-SY5Y细胞中目的基因KOR和B2R的RNA干扰 | 第56-57页 |
| 2.2.13 CCK-8 检测细胞增殖 | 第57-58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-81页 |
| 3.1 载体的构建及表达分析 | 第58-62页 |
| 3.1.1 重组质粒pcDNA3.1-OPRK1-Rluc的构建 | 第58-60页 |
| 3.1.2 重组质粒B2R-mVenus的构建 | 第60-62页 |
| 3.2 SH-SY5Y细胞中KOR和B2R基因的表达与鉴定 | 第62-63页 |
| 3.2.1 总RNA完整性检测 | 第62页 |
| 3.2.2 KOR和B2R基因的表达与鉴定 | 第62-63页 |
| 3.3 激光共聚焦显微镜检测KOR和B2R受体在细胞中的共定位 | 第63-64页 |
| 3.4 BRET检测KOR和B2R受体间的相互作用 | 第64-67页 |
| 3.5 FRET检测KOR和B2R受体间的相互作用 | 第67-69页 |
| 3.6 PLA检测KOR和B2R受体间的相互作用 | 第69-70页 |
| 3.7 KOR和B2R受体间的异源二聚化作用增强了细胞内cAMP表达水平 | 第70-72页 |
| 3.8 KOR/B2R异源二聚体激活了Gαs蛋白 | 第72页 |
| 3.9 Dyn A(1-13)能增强HEK293-KOR/B2R细胞内CRE的表达水平 | 第72-75页 |
| 3.10 Dyn A(1-13)能增强HEK293-KOR/B2R细胞内CREB的磷酸化水平 | 第75页 |
| 3.11 KOR/B2R二聚体介导的CREB的磷酸化依赖于PKA信号途径 | 第75-78页 |
| 3.12 KOR或B2R的沉默降低了KOR/B2R二聚体介导的CREB磷酸化 | 第78页 |
| 3.13 KOR/B2R二聚体促进了HEK293-KOR/B2R和SH-SY5Y细胞的增殖 | 第78-81页 |
| 4 讨论 | 第81-91页 |
| 4.1 KOR和B2R相互作用形成异源二聚体 | 第82-86页 |
| 4.2 KOR/B2R异源二聚体对信号转导途径的影响 | 第86-88页 |
| 4.3 KOR/B2R异源二聚体对细胞功能的影响 | 第88-90页 |
| 4.4 KOR/B2R二聚体形成的意义及研究展望 | 第90-91页 |
| 5 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 | 第106页 |
