| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 第一章 引言 | 第10-21页 |
| ·B-葡聚糖 | 第10页 |
| ·B-葡聚糖酶 | 第10-16页 |
| ·β-葡聚糖酶的定义与分类 | 第10-11页 |
| ·β-葡聚糖酶的来源 | 第11页 |
| ·β-葡聚糖酶的应用 | 第11-12页 |
| ·β-葡聚糖酶的分子生物学研究 | 第12-16页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的克隆 | 第12-14页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的表达与理化性质研究 | 第14-15页 |
| ·β-葡聚糖酶的高级结构 | 第15-16页 |
| ·外源基因表达系统 | 第16-18页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第18页 |
| ·定向进化技术 | 第18-19页 |
| ·蛋白质分离纯化技术 | 第19-20页 |
| ·课题研究主要内容和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-39页 |
| ·实验材料 | 第21-22页 |
| ·实验仪器 | 第21-22页 |
| ·药品 | 第22页 |
| ·菌株与质粒 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·实验方法 | 第22-39页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第22页 |
| ·质粒抽提 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌转化子的鉴定 | 第23-24页 |
| ·PCR方法鉴定阳性克隆子 | 第23页 |
| ·双酶切方法鉴定阳性克隆子 | 第23-24页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第24页 |
| ·EG编码基因的获取 | 第24-26页 |
| ·里氏木霉基因组DNA提取 | 第24页 |
| ·EG全基因序列的获取 | 第24-25页 |
| ·TA克隆获得pMD-18T-eg0质粒 | 第25页 |
| ·重叠延伸PCR法获取EG编码基因 | 第25-26页 |
| ·EG基因定点突变获取mutEG基因 | 第26-27页 |
| ·大肠杆菌表达EG编码基因 | 第27-29页 |
| ·重组质粒pET-32a-eg的构建 | 第27-28页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第28页 |
| ·pET-32a-eg转化E.coli BL21(DE3) | 第28-29页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pET-32a-eg诱导表达β-葡聚糖酶 | 第29页 |
| ·毕赤酵母表达EG编码基因和mutEG基因 | 第29-33页 |
| ·毕赤酵母系统表达载体pPIC9K | 第29-30页 |
| ·重组质粒pPIC9K-eg的构建 | 第30页 |
| ·重组质粒pPIC9K-muteg的构建 | 第30-31页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备 | 第31页 |
| ·pPIC9K-eg和pPIC9K-muteg转化Pichia pastoris GS115 | 第31-32页 |
| ·阳性转化子GS115-pPIC9K-eg和GS115-pPIC9K-muteg的筛选 | 第32-33页 |
| ·工程菌产酶条件的优化及其生长曲线与产酶曲线 | 第33页 |
| ·甲醇添加量优化 | 第33页 |
| ·培养基pH优化 | 第33页 |
| ·诱导OD优化 | 第33页 |
| ·工程菌GS115-pPIC9K-eg生长曲线与产酶曲线 | 第33页 |
| ·β-葡聚糖苷酶的分离纯化 | 第33-35页 |
| ·盐析 | 第34页 |
| ·脱盐 | 第34-35页 |
| ·离子柱层析 | 第35页 |
| ·疏水柱层析 | 第35页 |
| ·糖基化EG纯酶和MEG粗酶液理化性质研究 | 第35-39页 |
| ·重组β-葡聚糖酶的糖基化 | 第35-36页 |
| ·β-葡聚糖酶酶活定义及测定方法 | 第36-37页 |
| ·糖基化EG和MEG的最适温度及温度稳定性研究 | 第37-38页 |
| ·糖基化EG和MGE的最适pH和pH稳定性研究 | 第38页 |
| ·金属离子和还原剂对糖基化EG酶活的影响 | 第38-39页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第39-63页 |
| ·EG编码基因的获取 | 第39-41页 |
| ·里氏木霉基因组的提取 | 第39页 |
| ·EG全基因的获取 | 第39-40页 |
| ·EG编码基因的获取 | 第40-41页 |
| ·MUTEG的获取 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌表达EG编码基因 | 第42-45页 |
| ·pET-32a-eg重组质粒的构建 | 第42-44页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pET-32a-eg的诱导表达 | 第44-45页 |
| ·毕赤酵母表达EG编码基因和MUTEG基因 | 第45-51页 |
| ·毕赤酵母表达EG编码基因 | 第45-48页 |
| ·pPIC9K-eg重组质粒的构建 | 第45-46页 |
| ·工程菌GS115-pPIC9K-eg的筛选 | 第46-48页 |
| ·毕赤酵母表达mutEG基因 | 第48-51页 |
| ·pPIC9K-muteg重组质粒的构建 | 第48-49页 |
| ·工程菌GS115-pPIC9K-muteg的筛选 | 第49-51页 |
| ·工程菌产酶条件优化 | 第51-54页 |
| ·产酶条件的优化 | 第51-53页 |
| ·培养基甲醇添加量的优化 | 第51-52页 |
| ·培养基pH的优化 | 第52页 |
| ·工程菌初始诱导OD的优化 | 第52-53页 |
| ·工程菌生长曲线与产酶曲线 | 第53-54页 |
| ·B-葡聚糖酶分离纯化 | 第54-59页 |
| ·盐析预试验 | 第54-55页 |
| ·脱盐 | 第55-56页 |
| ·DEAE柱层析 | 第56页 |
| ·Butyl柱层析 | 第56-57页 |
| ·分离纯化表 | 第57-58页 |
| ·重组β-葡聚糖酶糖基化确定 | 第58-59页 |
| ·糖基化EG及MEG理化性质研究 | 第59-62页 |
| ·糖基化EG和MEG的最适温度及温度稳定性 | 第59-60页 |
| ·糖基化EG和MEG的最适pH和pH稳定性 | 第60-61页 |
| ·金属离子及还原剂对糖基化EG的影响 | 第61-62页 |
| ·讨论 | 第62-63页 |
| 第四章 结论与展望 | 第63-65页 |
| 结论 | 第63页 |
| 展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 附录 | 第72-79页 |
| 个人简历 | 第79页 |
