| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-30页 |
| ·血友病概况 | 第10页 |
| ·血友病的临床表现 | 第10-11页 |
| ·血液凝固过程 | 第11-17页 |
| ·内源性凝血途径 | 第13页 |
| ·外源性凝血途径 | 第13-14页 |
| ·凝血的共同途径 | 第14-17页 |
| ·血友病发病原理 | 第17-22页 |
| ·VIII 因子基因和蛋白 | 第17-20页 |
| ·F8 基因突变导致血友病 | 第20-22页 |
| ·血友病的治疗 | 第22-26页 |
| ·蛋白质替代疗法 | 第23-24页 |
| ·基因治疗 | 第24-25页 |
| ·生物工程重组 VIII 因子的展望 | 第25-26页 |
| ·VIII 因子抗原表位的研究现状 | 第26-28页 |
| ·课题意义以及研究内容 | 第28-30页 |
| 第二章 人凝血因子 VIII 重链和轻链的克隆、表达及纯化 | 第30-42页 |
| ·导言 | 第30页 |
| ·材料及仪器 | 第30-32页 |
| ·质粒及菌株 | 第30-31页 |
| ·酶及主要试剂 | 第31页 |
| ·主要仪器 | 第31-32页 |
| ·实验方法 | 第32-36页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第32页 |
| ·DNA 琼脂糖凝胶电泳 | 第32页 |
| ·PCR 产物回收 | 第32-33页 |
| ·人凝血因子 VIII 重链及轻链表达质粒的构建 | 第33页 |
| ·转化 | 第33页 |
| ·质粒抽提 | 第33-34页 |
| ·重组菌的小量诱导 | 第34-35页 |
| ·重组蛋白的大量表达 | 第35页 |
| ·蛋白包涵体的处理与纯化 | 第35-36页 |
| ·免疫印迹 | 第36页 |
| ·实验结果 | 第36-41页 |
| ·FVIII N 端（重链）和 C 端（轻链）重组质粒的构建原理 | 第36-37页 |
| ·重组表达质粒 pET21a-FVIII-N-His 和 pET21a-FVIII-C-His 的构建 | 第37-39页 |
| ·融合蛋白的表达和纯化 | 第39-40页 |
| ·免疫印迹分析 | 第40-41页 |
| ·讨论与小结 | 第41-42页 |
| 第三章 人凝血因子 VIII 重链及轻链抗血清的制备 | 第42-49页 |
| ·导言 | 第42页 |
| ·材料及仪器 | 第42-43页 |
| ·实验动物 | 第42页 |
| ·主要试剂 | 第42-43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·实验方法 | 第43-45页 |
| ·抗原制备 | 第43页 |
| ·动物免疫 | 第43-44页 |
| ·ELISA 测定抗血清效价 | 第44页 |
| ·免疫印迹 | 第44-45页 |
| ·实验结果 | 第45-47页 |
| ·抗原定量分析 | 第45页 |
| ·小鼠血清效价的测定 | 第45-46页 |
| ·免疫印迹分析 | 第46-47页 |
| ·讨论与小结 | 第47-49页 |
| 第四章 人凝血因子 VIII 轻链抗原表位的确定 | 第49-70页 |
| ·导言 | 第49页 |
| ·材料及仪器 | 第49-51页 |
| ·质粒和菌株 | 第49-50页 |
| ·酶、主要试剂 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50-51页 |
| ·实验方法 | 第51-56页 |
| ·FVIII-C 抗原表位的预测 | 第51页 |
| ·DNA 的琼脂糖电泳 | 第51页 |
| ·质粒抽提 | 第51-52页 |
| ·转化 | 第52页 |
| ·在表达载体 pET21a- FVIII-C 中引入 Flag 标签 | 第52-53页 |
| ·目的基因缺失突变以及定点突变 | 第53-56页 |
| ·重组菌的小量诱导 | 第56页 |
| ·免疫印迹 | 第56页 |
| ·数据处理 | 第56页 |
| ·实验结果 | 第56-69页 |
| ·人凝血因子 VIII 轻链抗原表位的预测 | 第56-58页 |
| ·重组表达质粒 pET21a- FVIII-C-flag 的构建 | 第58-60页 |
| ·人凝血因子 VIII 轻链基因的缺失突变和定点突变 | 第60-63页 |
| ·免疫印迹分析 | 第63-69页 |
| ·讨论与小结 | 第69-70页 |
| 第五章 人凝血因子 VIII 重链抗原表位的确定 | 第70-87页 |
| ·导言 | 第70页 |
| ·材料及仪器 | 第70-72页 |
| ·质粒和菌株 | 第70页 |
| ·酶、主要试剂 | 第70-71页 |
| ·主要仪器 | 第71-72页 |
| ·实验方法 | 第72-77页 |
| ·FVIII-N 抗原表位的预测 | 第72页 |
| ·DNA 的琼脂糖凝胶电泳 | 第72页 |
| ·质粒抽提 | 第72-73页 |
| ·转化 | 第73页 |
| ·在表达载体 pET21a-FVIII-N 中引入 Flag 标签 | 第73-74页 |
| ·目的基因的缺失突变及定点突变 | 第74-76页 |
| ·重组菌的小量诱导 | 第76页 |
| ·免疫印迹 | 第76-77页 |
| ·数据处理 | 第77页 |
| ·实验结果 | 第77-85页 |
| ·人凝血因子 VIII 重链抗原表位的预测 | 第77-79页 |
| ·重组表达质粒 pET21a- FVIII-N-flag 的构建 | 第79-80页 |
| ·人凝血因子 VIII 重链基因的缺失突变和定点突变 | 第80-82页 |
| ·免疫印迹分析 | 第82-85页 |
| ·讨论与小结 | 第85-87页 |
| 第六章 全文总结 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-92页 |
| 符号说明（附录 1） | 第92-94页 |
| 试剂配方（附录 2） | 第94-98页 |
| 附录一：蛋白表达纯化过程中所用试剂 | 第94-96页 |
| 附录二：免疫印迹试剂的配制 | 第96-98页 |
| 致谢 | 第98-100页 |
