| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 1 引言 | 第11-21页 |
| ·立题背景 | 第11-15页 |
| ·研究进展 | 第15-20页 |
| ·NICE 系统的概况和重组乳酸菌的研究进展 | 第15-18页 |
| ·REAL-TIME quantitative PCR 应用的研究进展 | 第18-20页 |
| ·目的与意义 | 第20页 |
| ·研究的内容 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-36页 |
| ·材料与仪器 | 第21-24页 |
| ·实验菌株、质粒和引物 | 第21页 |
| ·试剂、工具酶和试剂盒 | 第21-22页 |
| ·培养基配制和主要溶剂配制 | 第22-24页 |
| ·实验方法 | 第24-36页 |
| ·CBHⅡ基因的克隆 | 第24-27页 |
| ·含有重组质粒pETCBH 的Rosetta 工程菌的构建 | 第27-28页 |
| ·对含有重组质粒pETCBH 的Rosetta 工程菌进行诱导及活力测定 | 第28-30页 |
| ·乳酸乳球菌NZ9000 感受态的制备 | 第30页 |
| ·利用pNZ8148 表达引物亚克隆CBH 基因 | 第30页 |
| ·亚克隆CBHⅡ基因回收、连接和宿主菌的转化 | 第30-31页 |
| ·工程乳酸菌阳性克隆的验证 | 第31页 |
| ·利用REAL-TIME RT PCR 对工程乳酸菌CBHⅡ基因进行定量分析 | 第31-34页 |
| ·对含有重组质粒pNZCBH 的工程乳酸菌进行诱导及目的蛋白检测 | 第34-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-47页 |
| ·梯度PCR 确定扩增CBHⅡ基因最佳退火温度 | 第36-37页 |
| ·CBHⅡ基因 PCR 扩增产物与T 载体连接、转化后的克隆 | 第37-38页 |
| ·验证提取克隆的质粒pETCBH | 第38-39页 |
| ·蛋白质电泳（SDS-PAGE）检测Rosetta 工程菌表达的蛋白 | 第39页 |
| ·pNP 标准曲线绘制结果 | 第39-40页 |
| ·Rosetta 工程菌表达的CBHⅡ酶活性检测结果 | 第40页 |
| ·亚克隆CBHⅡ基因与pNZ8148 载体连接、转化后的克隆 | 第40-41页 |
| ·利用REAL-TIME RT PCR 对工程乳酸菌CBHⅡ基因进行定量分析 | 第41-46页 |
| ·不同方法提取工程乳酸菌总RNA 质量的比较 | 第41-42页 |
| ·绝对定量标准曲线的制备 | 第42-43页 |
| ·RT 样品与扣除部分样品Ct 值的测定和换算 | 第43-44页 |
| ·本实验方法的稳定性、重复性检验及REAL-TIME PCR 产物的特异性检测 | 第44-46页 |
| ·蛋白质电泳（SDS-PAGE）检测工程乳酸菌目的蛋白表达情况 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-51页 |
| ·关于实验材料的选择 | 第47-48页 |
| ·纤维素酶CBHⅡ基因的选择 | 第47页 |
| ·pET 载体和Rosetta 宿主菌的选择 | 第47-48页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色方法 | 第48页 |
| ·利用荧光定量分析目的基因的表达 | 第48-51页 |
| ·工程菌总RNA 的提取方法 | 第48-49页 |
| ·荧光定量分析方法 | 第49-50页 |
| ·REAL-TIME RT PCR 定量基因表达与传统转录水平分析基因表达的比较 | 第50-51页 |
| 5 结论 | 第51-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 附录 | 第57-59页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第59页 |
