| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第11-23页 |
| 1.1 淀粉酶概述 | 第11-12页 |
| 1.2 普鲁兰酶概述 | 第12-19页 |
| 1.2.1 普鲁兰酶的分类和作用方式 | 第12-13页 |
| 1.2.2 普鲁兰酶产生菌 | 第13-15页 |
| 1.2.3 普鲁兰酶的异源表达 | 第15-16页 |
| 1.2.4 普鲁兰酶的应用 | 第16-19页 |
| 1.2.4.1 普鲁兰酶应用在生产干啤酒中 | 第18页 |
| 1.2.4.2 普鲁兰酶应用在发酵生产高麦芽糖浆中 | 第18页 |
| 1.2.4.3 普鲁兰酶应用在发酵生产高葡萄糖糖浆中 | 第18-19页 |
| 1.3 Ⅰ型普鲁兰酶(Type Ⅰ)概述 | 第19-20页 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌表达系统介绍 | 第20-21页 |
| 1.4.1 Bacillus subtilis作为表达宿主的优缺点 | 第20-21页 |
| 1.4.2 外源基因的表达 | 第21页 |
| 1.5 课题意义和课题研究内容 | 第21-23页 |
| 第2章 菌种的分类学地位鉴定与生理生化特性 | 第23-32页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.2.1 菌株 | 第23页 |
| 2.2.2 培养基和使用方法 | 第23页 |
| 2.2.3 载体和工具酶 | 第23页 |
| 2.2.4 试剂,仪器与耗材 | 第23-24页 |
| 2.2.5 PCR引物 | 第24页 |
| 2.3 实验方法与步骤 | 第24-27页 |
| 2.3.1 细菌的生理生化试验 | 第25-26页 |
| 2.3.1.1 触酶试验：过氧化氢酶试验 | 第25页 |
| 2.3.1.2 Voges Proskauer(V-P)试验 | 第25页 |
| 2.3.1.3 氧化酶试验 | 第25页 |
| 2.3.1.4 尿酶试验 | 第25页 |
| 2.3.1.5 糖醇利用试验 | 第25-26页 |
| 2.3.1.6 不同温度条件下的生长情况 | 第26页 |
| 2.3.2 分子生物学16S rDNA序列分析 | 第26-27页 |
| 2.3.2.1 细菌基因组DNA的提取 | 第26页 |
| 2.3.2.2 16S rNA基因序列扩增 | 第26-27页 |
| 2.3.2.3 目的产物的回收 | 第27页 |
| 2.3.2.4 TA克隆 | 第27页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第27-30页 |
| 2.4.1 原始菌Nws-pp2普鲁兰酶酶活检测 | 第27-28页 |
| 2.4.2 16S rDNA序列分析 | 第28-30页 |
| 2.4.2.1 细菌总DNA的抽提 | 第28-29页 |
| 2.4.2.2 16S rNA的序列分析 | 第29-30页 |
| 2.4.3 Nws-pp2生理生化试验 | 第30页 |
| 2.5 本章小结 | 第30-32页 |
| 第3章 普鲁兰酶的基因克隆以及重组质粒的构建 | 第32-52页 |
| 3.1 引言 | 第32页 |
| 3.2 实验材料 | 第32-37页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第32-35页 |
| 3.2.2 工具酶和试剂盒 | 第35页 |
| 3.2.3 培养基和溶液 | 第35-36页 |
| 3.2.4 试剂,仪器与耗材 | 第36-37页 |
| 3.2.5 PCR引物 | 第37页 |
| 3.3 实验方法与步骤 | 第37-41页 |
| 3.3.1 细菌基因组DNA的提取 | 第37页 |
| 3.3.2 质粒DNA的提取 | 第37-38页 |
| 3.3.3 核酸电泳凝胶回收 | 第38-39页 |
| 3.3.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第39页 |
| 3.3.5 TA克隆 | 第39页 |
| 3.3.6 大肠杆菌感受态制备及转化 | 第39-40页 |
| 3.3.7 枯草芽孢杆菌感受态制备及转化 | 第40-41页 |
| 3.3.8 菌种保藏 | 第41页 |
| 3.4 pulN基因克隆与分析 | 第41-42页 |
| 3.4.1 简并PCR扩增 | 第41-42页 |
| 3.4.2 TA克隆的菌落PCR验证 | 第42页 |
| 3.5 重组质粒的构建 | 第42-45页 |
| 3.5.1 克隆载体与目的基因的连接 | 第42-43页 |
| 3.5.2 酶切 | 第43-44页 |
| 3.5.3 连接双酶切产物并转化 | 第44-45页 |
| 3.6 实验结果与讨论 | 第45-49页 |
| 3.6.1 普鲁兰酶基因的获得与分析 | 第45-48页 |
| 3.6.2 重组表达载体的验证 | 第48-49页 |
| 3.7 本章小结 | 第49-52页 |
| 第4章 普鲁兰酶的表达,酶学性质和底物催化的研究 | 第52-72页 |
| 4.1 引言 | 第52页 |
| 4.2 实验材料 | 第52-56页 |
| 4.2.1 菌种和质粒 | 第52页 |
| 4.2.2 试剂盒与工具酶 | 第52页 |
| 4.2.3 培养基与溶液 | 第52-54页 |
| 4.2.4 试剂、仪器与耗材 | 第54-56页 |
| 4.3 实验方法与步骤 | 第56-60页 |
| 4.3.1 重组菌的诱导表达及超声破碎 | 第56页 |
| 4.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳凝胶的配制 | 第56页 |
| 4.3.3 葡萄糖标准曲线绘制 | 第56-57页 |
| 4.3.4 重组普鲁兰酶酶活测定 | 第57页 |
| 4.3.5 Bradford法定蛋白浓度 | 第57-58页 |
| 4.3.6 重组蛋白的亲和层析纯化 | 第58-59页 |
| 4.3.7 酶反应动力学参数的测量 | 第59页 |
| 4.3.8 温度和pH对酶活的影响 | 第59页 |
| 4.3.9 各金属离子和化学试剂对酶活的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.10 重组普鲁兰酶降解底物底物谱分析 | 第60页 |
| 4.3.11 降解不同底物的产物分析 | 第60页 |
| 4.4 实验结果与分析 | 第60-71页 |
| 4.4.1 目的蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第60-64页 |
| 4.4.1.1 目的蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第60-63页 |
| 4.4.1.2 重组蛋白的纯化 | 第63-64页 |
| 4.4.2 目的蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第64-65页 |
| 4.4.3 酶反应动力学参数 | 第65-66页 |
| 4.4.4 反应温度和pH对酶活的影响 | 第66-67页 |
| 4.4.5 金属离子和化学试剂对酶活的影响 | 第67-68页 |
| 4.4.6 重组普鲁兰酶PulN可降解底物及产物分析 | 第68-71页 |
| 4.5 本章小结 | 第71-72页 |
| 第5章 结论与展望 | 第72-74页 |
| 5.1 文章结论 | 第72页 |
| 5.2 展望 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
