| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 综述与导言 | 第10-21页 |
| 1.1 链霉菌 | 第10-13页 |
| 1.1.1 链霉菌简介 | 第10-11页 |
| 1.1.2 链霉菌次生代谢调控 | 第11-13页 |
| 1.2 抗生素简介 | 第13-14页 |
| 1.3 Ba-emycin研究背景 | 第14-18页 |
| 1.3.1 Bagremycin的发现 | 第14-15页 |
| 1.3.2 Bagremycin的结构 | 第15页 |
| 1.3.3 Bagremycin的分离与发酵 | 第15-17页 |
| 1.3.4 Bagremycin生物学特性 | 第17-18页 |
| 1.4 Bagremycin合成途径研究进展 | 第18-20页 |
| 1.5 课题研究意义 | 第20-21页 |
| 第2章 材料与方法 | 第21-46页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第21-30页 |
| 2.1.1 试剂及药品 | 第21-23页 |
| 2.1.2 培养基 | 第23-24页 |
| 2.1.3 缓冲液 | 第24-25页 |
| 2.1.4 菌种 | 第25-26页 |
| 2.1.5 载体质粒 | 第26页 |
| 2.1.6 重组质粒 | 第26-27页 |
| 2.1.7 引物 | 第27-29页 |
| 2.1.8 常用抗生素和诱导剂 | 第29页 |
| 2.1.9 仪器和设备 | 第29-30页 |
| 2.2 微生物学方法 | 第30-31页 |
| 2.2.1 微生物培养条件 | 第30-31页 |
| 2.2.2 菌种保藏 | 第31页 |
| 2.3 遗传学方法 | 第31页 |
| 2.3.1 制备E.coli感受态细胞 | 第31页 |
| 2.3.2 质粒转化-CaCl_2法 | 第31页 |
| 2.4 分子生物学方法 | 第31-41页 |
| 2.4.1 DNA抽提方法 | 第31-32页 |
| 2.4.2 DNA酶切 | 第32页 |
| 2.4.3 DNA连接 | 第32-33页 |
| 2.4.4 In-Fusion连接 | 第33页 |
| 2.4.5 乙醇沉淀DNA | 第33页 |
| 2.4.6 DNA回收 | 第33页 |
| 2.4.7 链霉菌RNA提取 | 第33-34页 |
| 2.4.8 反转录PCR(RT-PCR) | 第34页 |
| 2.4.9 bagH、bagI和bagM的基因敲除 | 第34-36页 |
| 2.4.10 bagI基因回补与过表达 | 第36-38页 |
| 2.4.11 HPLC-MS检测抗生素发酵 | 第38页 |
| 2.4.12 bagI缺失突变对次级代谢的影响 | 第38-40页 |
| 2.4.13 BagI作为转录激活子参与代谢调控 | 第40-41页 |
| 2.5 BagI重组蛋白表达与纯化 | 第41-44页 |
| 2.5.1 表达载体构建 | 第41-42页 |
| 2.5.2 BagI重组蛋白表达 | 第42页 |
| 2.5.3 BagI重组蛋白分离纯化 | 第42页 |
| 2.5.4 SDS-PAGE电泳 | 第42-43页 |
| 2.5.5 蛋白质印迹(Western blot) | 第43页 |
| 2.5.6 蛋白浓度测定 | 第43-44页 |
| 2.6 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第44-45页 |
| 2.6.1 实验原理 | 第44页 |
| 2.6.2 实验步骤 | 第44-45页 |
| 2.7 课题中所用软件及数据库 | 第45-46页 |
| 第3章 结果与分析 | 第46-77页 |
| 3.1 bagI等Bagremycin疑似生物合成基因的信息生物学预测分析 | 第46-49页 |
| 3.1.1 与Bagremycin生物合成相关基因 | 第46页 |
| 3.1.2 部分bag基因功能的信息生物学预测 | 第46-47页 |
| 3.1.3 bagI基因序列分析 | 第47-49页 |
| 3.2 bagI、bagH和bagM与Bagremycin生物合成的相关性鉴定 | 第49-62页 |
| 3.2.1 敲除质粒的构建 | 第50-52页 |
| 3.2.2 结合转移 | 第52-53页 |
| 3.2.3 二次重组子筛选和鉴定 | 第53-55页 |
| 3.2.4 HPLC/TOF-MS检测发酵产物 | 第55-57页 |
| 3.2.5 bagI基因回补与过表达 | 第57-62页 |
| 3.3 bagI缺失突变对次级代谢的影响 | 第62-69页 |
| 3.3.1 bagI缺失突变对生长环境(pH)的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.2 bagI缺失突变对菌丝生长的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.3 bagI缺失突变对孢子发育的影响 | 第64-66页 |
| 3.3.4 bagI缺失突变对色素产量的影响 | 第66-67页 |
| 3.3.5 bagI缺失突变对Bagremycin产量的影响 | 第67-69页 |
| 3.4 BagI作为转录激活子参与代谢调控 | 第69-72页 |
| 3.4.1 野生株和敲除株总RNA抽提 | 第69-70页 |
| 3.4.2 基因组去除与反转录 | 第70页 |
| 3.4.3 反转录PCR(RT-PCR) | 第70页 |
| 3.4.4 bagI基因对代谢途径的调节表现为正调控 | 第70-72页 |
| 3.5 BagI蛋白表达 | 第72-75页 |
| 3.5.1 表达质粒的构建 | 第72-73页 |
| 3.5.2 BagI蛋白表达 | 第73-74页 |
| 3.5.3 BagI蛋白分离纯化 | 第74页 |
| 3.5.4 蛋白质浓度检测(Bradford法) | 第74-75页 |
| 3.5.5 蛋白质印迹(Western Blot) | 第75页 |
| 3.6 BagI作为转录激活子的体外证据 | 第75-77页 |
| 3.6.1 启动子区克隆 | 第75页 |
| 3.6.2 Native-PAGE实验 | 第75-77页 |
| 第4章 研究结果与展望 | 第77-85页 |
| 4.1 本课题研究结果分析 | 第77-83页 |
| 4.1.1 bagl基因属于SARP蛋白家族 | 第77-78页 |
| 4.1.2 bagI基因框内敲除与回补分析 | 第78-79页 |
| 4.1.3 bagI基因在次生代谢中的作用 | 第79-80页 |
| 4.1.4 BagI作为激活子发挥调控作用 | 第80-81页 |
| 4.1.5 体外实验结果分析 | 第81-83页 |
| 4.2 课题展望 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
