| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 前言 | 第10-26页 |
| 1.1 糖尿病视网膜病变的研究进展 | 第11-18页 |
| 1.1.1 糖尿病视网膜病变的分类 | 第11-13页 |
| 1.1.2 糖尿病视网膜病变的发病机制及危害 | 第13-15页 |
| 1.1.3 目前治疗糖尿病视网膜病变的主要方法及优缺点 | 第15-17页 |
| 1.1.4 糖尿病视网膜病变的老鼠模型实验研究 | 第17-18页 |
| 1.2 血管生物抑制因子 | 第18-21页 |
| 1.2.1 血管生成抑制因子 | 第18-20页 |
| 1.2.2 Canstatin及Canstatin-N的研究 | 第20-21页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第21-23页 |
| 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 | 第21页 |
| 1.3.2 pAOX1表达系统 | 第21-22页 |
| 1.3.3 pGAP表达系统 | 第22-23页 |
| 1.4 本研究的意义、内容以及技术路线 | 第23-26页 |
| 1.4.1 研究的意义 | 第23-24页 |
| 1.4.2 研究的内容 | 第24-25页 |
| 1.4.3 技术路线 | 第25-26页 |
| 第2章 CN基因的克隆及表达载体的构建 | 第26-40页 |
| 2.1 材料与方法 | 第26-35页 |
| 2.1.1 材料 | 第26-28页 |
| 2.1.1.1 质粒与菌株 | 第26页 |
| 2.1.1.2 实验常用酶和试剂 | 第26页 |
| 2.1.1.3 实验常用培养基 | 第26-27页 |
| 2.1.1.4 质粒提取试剂 | 第27页 |
| 2.1.1.5 核酸电泳溶液 | 第27页 |
| 2.1.1.6 主要实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.1.2. 实验方法 | 第28-35页 |
| 2.1.2.1. PCR扩增canstatin-N基因 | 第28页 |
| 2.1.2.2 PCR反应体系及反应条件 | 第28-29页 |
| 2.1.2.3 PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第29页 |
| 2.1.2.4 DNA的琼脂糖凝胶回收 | 第29页 |
| 2.1.2.5 载体质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.1.2.6 质粒载体及目的基因的酶切 | 第30-31页 |
| 2.1.2.6.1 pGAP9K载体质粒酶切 | 第30-31页 |
| 2.1.2.6.2 PCR产物的酶切 | 第31页 |
| 2.1.2.7 连接与转化 | 第31-33页 |
| 2.1.2.7.1 载体与目的基因的连接 | 第31-32页 |
| 2.1.2.7.2 E.coli感受态的制备 | 第32页 |
| 2.1.2.7.3 转化 | 第32-33页 |
| 2.1.2.8 重组子的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.1.2.8.1 酶切鉴定 | 第33页 |
| 2.1.2.8.2 菌液PCR鉴定 | 第33-34页 |
| 2.1.2.9 测序比对分析 | 第34-35页 |
| 2.2 结果与分析 | 第35-39页 |
| 2.2.1 扩增CN基因 | 第35页 |
| 2.2.2 表达载体的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.3 表达载体pGAP9K-CN的构建 | 第36页 |
| 2.2.4 重组子的鉴定 | 第36-38页 |
| 2.2.4.1 酶切鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.4.2 PCR鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.5 测序分析 | 第38-39页 |
| 2.3 本章小结 | 第39-40页 |
| 第3章 CN重组蛋白的生产及治疗视网膜血管增生 | 第40-63页 |
| 3.1 材料与方法 | 第40-54页 |
| 3.1.1 实验材料及试剂 | 第40-46页 |
| 3.1.1.1 实验材料 | 第40页 |
| 3.1.1.2 实验常用的酶和试剂 | 第40-41页 |
| 3.1.1.3 常用培养基 | 第41-43页 |
| 3.1.1.4 主要实验仪器 | 第43页 |
| 3.1.1.5 质粒提取试剂 | 第43-44页 |
| 3.1.1.6 核酸与蛋白电泳溶液 | 第44-45页 |
| 3.1.1.7 蛋白纯化主要试剂 | 第45页 |
| 3.1.1.8 实验中常用的其他试剂 | 第45-46页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第46-54页 |
| 3.1.2.1 重组质粒线性化 | 第46页 |
| 3.1.2.2 毕赤酵母感受态的制备 | 第46-47页 |
| 3.1.2.3 清洗电击杯的流程 | 第47页 |
| 3.1.2.4 重组表达载体电转化毕赤酵母 | 第47页 |
| 3.1.2.5 重组子的筛选 | 第47-48页 |
| 3.1.2.5.1 高拷贝转化子的筛选 | 第47-48页 |
| 3.1.2.5.2 菌液PCR法筛选 | 第48页 |
| 3.1.2.6 组成型摇瓶表达 | 第48-49页 |
| 3.1.2.7 重组酵母的高密度发酵 | 第49页 |
| 3.1.2.8 表达产物的TCA沉淀法 | 第49页 |
| 3.1.2.9 重组蛋白的检测 | 第49-50页 |
| 3.1.2.10 重组蛋白的初步纯化 | 第50-51页 |
| 3.1.2.11 纯化后的高密度蛋白的透析处理 | 第51页 |
| 3.1.2.11.1 透析袋的使用前处理 | 第51页 |
| 3.1.2.11.2 纯化后的透析处理 | 第51页 |
| 3.1.2.12 重组蛋白对CAM血管生成抑制活性的测定 | 第51-52页 |
| 3.1.2.13 内皮细胞凋亡的试验 | 第52页 |
| 3.1.2.14 重组蛋白对糖尿病视网膜病变的治疗 | 第52-54页 |
| 3.2 实验结果 | 第54-62页 |
| 3.2.1 表达载体线性化 | 第54页 |
| 3.2.2 菌落PCR筛选重组子 | 第54-55页 |
| 3.2.3 重组酵母工程菌的摇瓶表达 | 第55-56页 |
| 3.2.4 重组子的高密度发酵和表达蛋白纯化 | 第56-57页 |
| 3.2.5 重组蛋白对CAM血管生成抑制活性的测定 | 第57-58页 |
| 3.2.6 重组蛋白对人脐带静脉细胞的抑制作用 | 第58页 |
| 3.2.7 重组蛋白治疗糖尿病视网膜增生 | 第58-62页 |
| 3.3 本章小结 | 第62-63页 |
| 第四章 讨论与结论 | 第63-68页 |
| 4.1 讨论 | 第63-66页 |
| 4.1.1 Canstatin蛋白治疗血管增生 | 第63-64页 |
| 4.1.2 表达体系的选择 | 第64-65页 |
| 4.1.3 注射法与滴眼法治疗的比较 | 第65-66页 |
| 4.1.4 本研究中值得深入探讨的问题 | 第66页 |
| 4.2 本研究的结论 | 第66-67页 |
| 4.3 本研究的主要创新点 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-75页 |
| 附录：缩写词(Abbreviation) | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
