| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-22页 |
| 1.1 苯丙氨酸的特性及应用 | 第10-11页 |
| 1.1.1 苯丙氨酸的化学及物理特性 | 第10页 |
| 1.1.2 苯丙氨酸的应用 | 第10-11页 |
| 1.2 苯丙氨酸的生产方法 | 第11页 |
| 1.2.1 苯丙氨酸的化学合成方法 | 第11页 |
| 1.2.2 苯丙氨酸的生物合成方法 | 第11页 |
| 1.3 苯丙氨酸的合成代谢途径及调控机制 | 第11-14页 |
| 1.3.1 苯丙氨酸合成途径概述 | 第11-13页 |
| 1.3.2 苯丙氨酸合成途径的调控机制 | 第13-14页 |
| 1.4 苯丙氨酸的高产育种策略 | 第14-16页 |
| 1.4.1 加强重要前体物质的DAHP合成 | 第14页 |
| 1.4.2 对途径间的竞争抑制的解除 | 第14-15页 |
| 1.4.3 对途径内的反馈抑制的解除 | 第15-16页 |
| 1.5 分子生物学理论基础及其改造方法 | 第16-18页 |
| 1.5.1 基因敲除技术 | 第16-17页 |
| 1.5.2 基因定点突变技术 | 第17-18页 |
| 1.6 高密度培养技术概述 | 第18-20页 |
| 1.7 论文研究的主要内容 | 第20-22页 |
| 1.7.1 课题的研究意义 | 第20-21页 |
| 1.7.2 课题研究的主要内容 | 第21-22页 |
| 第二章 苯丙氨酸合成竞争途径trpE基因的敲除 | 第22-46页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料与设备 | 第22-27页 |
| 2.2.1 主要仪器设备 | 第22-23页 |
| 2.2.2 实验材料 | 第23-27页 |
| 2.2.3 引物设计 | 第27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-36页 |
| 2.3.0 同源重组片段模版质粒pKD3的提取 | 第27-28页 |
| 2.3.1 Escherichia coli try△tyrA化转感受态的制备 | 第28-29页 |
| 2.3.2 同源重组酶表达pKD46的提取 | 第29页 |
| 2.3.3 将pKD46转化到制备好的Escherichia coli try△tyrA化转感受态中 | 第29页 |
| 2.3.4 含有pKD46的Escherichia coli try△tyr A制备电转感受态 | 第29-30页 |
| 2.3.5 同源臂-氯霉素抗性片段的扩增与纯化 | 第30-32页 |
| 2.3.6 同源臂-氯霉素抗性片段的电转化 | 第32页 |
| 2.3.7 电转转化子的PCR筛选及氯霉素抗性的消除 | 第32-35页 |
| 2.3.8 trpE敲除菌生长曲线的测定 | 第35页 |
| 2.3.9 trpE敲除菌的苯丙氨酸摇瓶发酵 | 第35页 |
| 2.3.10 发酵液中苯丙氨酸的HPLC测定 | 第35-36页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第36-45页 |
| 2.4.1 Red重组相关质粒的获取及鉴定 | 第36-37页 |
| 2.4.2 Red重组技术对trpE基因进行敲除 | 第37-41页 |
| 2.4.3 敲除菌株的生长特征 | 第41-42页 |
| 2.4.4 敲除菌株摇瓶发酵的苯丙氨酸HPLC测定 | 第42-45页 |
| 2.5 本章小结 | 第45-46页 |
| 第三章 苯丙氨酸合成途径关键基因aroF、pheA~(fbr)的强化表达 | 第46-66页 |
| 3.1 引言 | 第46页 |
| 3.2 实验材料与设备 | 第46-48页 |
| 3.2.1 主要仪器与设备 | 第46页 |
| 3.2.2 实验材料 | 第46-47页 |
| 3.2.3 引物设计 | 第47-48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48-57页 |
| 3.3.1 Escherichia coli Mach1T1感受态的制备 | 第48-49页 |
| 3.3.2 野生型大肠杆菌Escherichia coli W3110基因组的提取 | 第49页 |
| 3.3.3 pACYC184、pTrc99A载体质粒的提取 | 第49页 |
| 3.3.4 pACYC184、pTrc99A质粒的酶切和胶回收 | 第49-51页 |
| 3.3.5 pheA~(fbr)和aroF单基因表达载体的构建 | 第51-56页 |
| 3.3.6 重组质粒导入宿主菌 | 第56-57页 |
| 3.3.7 单基因增强表达菌株的摇瓶发酵及苯丙氨酸产量的HPLC测定 | 第57页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第57-65页 |
| 3.4.1 Escherichia coli W3110的基因组提取 | 第57-58页 |
| 3.4.2 载体质粒pACYC184、pTrc99A的提取及酶切 | 第58-59页 |
| 3.4.3 重组质粒的构建 | 第59-63页 |
| 3.4.4 四个重组质粒导入宿主菌 | 第63页 |
| 3.4.5 单基因强化表达的重组菌株摇瓶发酵苯丙氨酸HPLC测定 | 第63-65页 |
| 3.5 本章小结 | 第65-66页 |
| 第四章 苯丙氨酸合成途径关键基因aroF、pheA~(fbr)的组合表达 | 第66-86页 |
| 4.1 引言 | 第66页 |
| 4.2 实验材料和设备 | 第66-69页 |
| 4.2.1 主要仪器与设备 | 第66页 |
| 4.2.2 实验材料 | 第66-69页 |
| 4.3 实验方法 | 第69-76页 |
| 4.3.1 pheA~(fbr)基因和aroF基因在同一个载体上的同时表达 | 第69-72页 |
| 4.3.2 pheA~(fbr)基因和aroF基因在不同载体上的同时表达 | 第72-73页 |
| 4.3.3 改造菌株的摇瓶发酵及HPLC检测 | 第73页 |
| 4.3.4 摇瓶最优株E7的 5L发酵罐小试 | 第73-75页 |
| 4.3.5 发酵过程指标的测定 | 第75-76页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第76-84页 |
| 4.4.1 低拷贝质粒pACYC184-pheA~(fbr)-aroF（E3）的构建 | 第76-77页 |
| 4.4.2 高拷贝质粒pTrc99A-pheA~(fbr)-aroF（E6）的构建 | 第77-78页 |
| 4.4.3 高拷贝质粒pTrc99A-pheA~(fbr)-TP-aroF（E7）的构建 | 第78-79页 |
| 4.4.4 单质粒表达菌株E3、E6、E7的转化 | 第79-80页 |
| 4.4.5 双质粒表达菌株D1、D2的构建 | 第80页 |
| 4.4.6 改造菌株的摇瓶发酵及HPLC检测 | 第80-81页 |
| 4.4.7 E7菌株的 5L发酵罐发酵检测 | 第81-84页 |
| 4.5 本章小结 | 第84-86页 |
| 结论与展望 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-92页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 | 第94页 |
