| 摘要 | 第10-11页 |
| 英文摘要 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-18页 |
| 1.1 苜蓿夜蛾 | 第13页 |
| 1.2 鳞翅目昆虫消化酶 | 第13页 |
| 1.3 昆虫丝氨酸蛋白酶的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.4 昆虫丝氨酸蛋白酶的分类与结构 | 第14-16页 |
| 1.4.1 昆虫胰蛋白酶 | 第14-15页 |
| 1.4.2 昆虫胰凝乳蛋白酶 | 第15-16页 |
| 1.5 昆虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 | 第16-17页 |
| 1.6 本研究的目的与意义 | 第17-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-38页 |
| 2.1 试验材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 供试昆虫 | 第18页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第18页 |
| 2.1.3 主要分子生物学试剂 | 第18页 |
| 2.1.4 所需溶液的配制 | 第18-19页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 2.2 苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因的克隆 | 第20-29页 |
| 2.2.1 RNA提取 | 第20页 |
| 2.2.2 cDNA第一链的合成 | 第20-21页 |
| 2.2.3 丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列片段克隆 | 第21-24页 |
| 2.2.4 利用RACE克隆基因的3'cDNA序列和5'cDNA序列 | 第24-29页 |
| 2.2.5 丝氨酸蛋白酶全长cDNA序列的获得 | 第29页 |
| 2.3 序列分析 | 第29-30页 |
| 2.3.1 序列相似性分析 | 第29页 |
| 2.3.2 核苷酸序列分析 | 第29页 |
| 2.3.3 蛋白质基本性质与结构分析 | 第29-30页 |
| 2.3.4 多重比对与系统进化分析 | 第30页 |
| 2.4 丝氨酸蛋白酶基因的原核表达及活性测定 | 第30-34页 |
| 2.4.1 丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.4.2 酶切反应 | 第31页 |
| 2.4.3 大肠杆菌表达载体的构建 | 第31-32页 |
| 2.4.4 丝氨酸蛋白酶基因的诱导表达和SDS-PAGE | 第32-33页 |
| 2.4.5 重组蛋白变性、纯化与复性 | 第33-34页 |
| 2.4.6 重组蛋白的活性测定 | 第34页 |
| 2.5 丝氨酸蛋白酶基因在苜蓿夜蛾不同组织中的特异性表达 | 第34-36页 |
| 2.5.1 丝氨酸蛋白酶基因在不同组织的表达 | 第34-35页 |
| 2.5.2 荧光定量PCR引物设计 | 第35页 |
| 2.5.3 荧光定量PCR的反应体系和步骤 | 第35页 |
| 2.5.4 荧光定量PCR的数据处理 | 第35-36页 |
| 2.6 丝氨酸蛋白酶基因的RNAi研究 | 第36-38页 |
| 2.6.1 设计引物RNAi引物 | 第36页 |
| 2.6.2 体外合成dsRNA | 第36-37页 |
| 2.6.3 dsRNA的纯化 | 第37页 |
| 2.6.4 dsRNA的注射 | 第37页 |
| 2.6.5 RNA干扰效果的检测 | 第37-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-54页 |
| 3.1 Hv SP基因cDNA的克隆 | 第38-39页 |
| 3.1.1 苜蓿夜蛾总RNA的提取 | 第38页 |
| 3.1.2 HvSPcDNA的克隆 | 第38-39页 |
| 3.2 HvSP基因cDNA序列分析及系统发育分析 | 第39-43页 |
| 3.2.1 HvSP基因cDNA的序列分析 | 第39-40页 |
| 3.2.2 HvSP基因同源性比较和系统进化树分析 | 第40-43页 |
| 3.3 HvSP基因推导的氨基酸特征分析 | 第43-46页 |
| 3.3.1 苜蓿夜蛾总RNA的提取 | 第43页 |
| 3.3.2 信号肽分析 | 第43-44页 |
| 3.3.3 氨基酸疏水性分析 | 第44-45页 |
| 3.3.4 N-糖基化位点分析 | 第45页 |
| 3.3.5 蛋白三维模型构建 | 第45-46页 |
| 3.4 HvSP基因的原核表达及活性测定 | 第46-49页 |
| 3.4.1 HvSP基因重组表达载体的构建及鉴定 | 第46-47页 |
| 3.4.2 重组蛋白HvSP-pET21b的诱导表达 | 第47-48页 |
| 3.4.3 重组蛋白的纯化、复性和活性测定 | 第48-49页 |
| 3.5 HvSP基因在不同组织的表达分析 | 第49-51页 |
| 3.5.1 荧光定量PCR引物特异性检验 | 第49-51页 |
| 3.5.2 HvSP在不同组织的表达分析 | 第51页 |
| 3.6 RNAi结果分析 | 第51-54页 |
| 3.6.1 dsRNA的合成 | 第51-52页 |
| 3.6.2 RNAi处理后HvSP基因表达量的变化 | 第52-54页 |
| 4 讨论 | 第54-58页 |
| 4.1 HvSP基因的克隆及序列分析 | 第54页 |
| 4.2 HvSP基因的原核表达及活性分析 | 第54-55页 |
| 4.3 HvSP基因在不同组织表达研究 | 第55-56页 |
| 4.4 HvSP基因的RNAi研究 | 第56-58页 |
| 5 结论 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第67页 |
