| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-25页 |
| ·工业生物催化剂研究概述 | 第13页 |
| ·烟酰胺辅酶再生研究方法概述 | 第13-16页 |
| ·化学法 | 第14页 |
| ·光化学法 | 第14页 |
| ·电化学法 | 第14-15页 |
| ·生物法 | 第15页 |
| ·底物耦联再生法 | 第15页 |
| ·酶耦联再生法 | 第15页 |
| ·微生物再生法 | 第15-16页 |
| ·酶法再生辅酶实例 | 第16页 |
| ·酶法辅酶再生的研究方向 | 第16页 |
| ·酶的固定化方法研究概述 | 第16-19页 |
| ·吸附法 | 第17页 |
| ·共价法 | 第17页 |
| ·交联法 | 第17-18页 |
| ·包埋法 | 第18页 |
| ·印迹酶固定法 | 第18页 |
| ·交联酶晶体 | 第18页 |
| ·交联聚集体 | 第18-19页 |
| ·新型固定化材料 | 第19页 |
| ·固定化酶的应用概述 | 第19-20页 |
| ·医药医学领域 | 第19-20页 |
| ·食品工业 | 第20页 |
| ·化工行业 | 第20页 |
| ·环保能源领域 | 第20页 |
| ·亚磷酸脱氢酶研究概述 | 第20-24页 |
| ·亚磷酸脱氢酶(PTDH)的发现 | 第21页 |
| ·亚磷酸脱氢酶的结构及理化性质 | 第21-22页 |
| ·亚磷酸脱氢酶的催化机理 | 第22页 |
| ·亚磷酸脱氢酶的应用 | 第22-24页 |
| ·研究目的和意义 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-46页 |
| ·材料 | 第25-28页 |
| ·菌株与质粒 | 第25-26页 |
| ·试剂 | 第26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·溶液 | 第26-28页 |
| ·仪器设备 | 第28页 |
| ·亚磷酸脱氢酶基因ptxD的人工优化合成与克隆 | 第28-31页 |
| ·亚磷酸脱氢酶基因ptxD的人工优化合成 | 第28页 |
| ·碱裂法抽提含有亚磷酸脱氢酶基因ptxD的合成质粒 | 第28-29页 |
| ·目的基因亚磷酸脱氢酶ptxD的酶切、回收 | 第29页 |
| ·载体pGEX-6p-1的制备 | 第29-30页 |
| ·酶连 | 第30页 |
| ·重组质粒的转化与验证 | 第30-31页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的表达与纯化 | 第31-34页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的诱导表达 | 第31-32页 |
| ·SDS-PAGE凝胶的配制 | 第32-33页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的纯化 | 第33-34页 |
| ·凝胶电泳和蛋白浓度测定 | 第34页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的酶学性质研究 | 第34-37页 |
| ·NADH标准曲线的绘制 | 第34页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH活性的测定方法 | 第34-35页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的最适温度和热稳定性 | 第35页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的最适pH和pH稳定性 | 第35-36页 |
| ·金属离子和化学试剂对亚磷酸脱氢酶PTDH活性影响 | 第36页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH酶动力学参数测定 | 第36页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH同源建模 | 第36-37页 |
| ·亚磷酸脱氢酶基因ptxD随机突变文库的构建 | 第37-39页 |
| ·易错PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因 | 第37页 |
| ·易错PCR产物的纯化、回收与酶切 | 第37页 |
| ·载体pGEX-6p-1的制备 | 第37-38页 |
| ·酶连 | 第38页 |
| ·重组质粒转化及验证 | 第38页 |
| ·随机突变文库的筛选方法 | 第38-39页 |
| ·随机突变株蛋白的诱导表达和纯化 | 第39页 |
| ·突变蛋白的基本酶学性质和酶动力学常数测定 | 第39页 |
| ·亚磷酸脱氢酶(PTDH)139位点的饱和突变研究 | 第39-43页 |
| ·饱和突变引物设计 | 第39页 |
| ·重叠延伸PCR(SOE-PCR)法饱和突变 | 第39-42页 |
| ·重叠延伸PCR产物回收、酶切 | 第42页 |
| ·载体pGEX-6p-1的制备 | 第42页 |
| ·酶连 | 第42页 |
| ·重组质粒转化及验证 | 第42页 |
| ·亚磷酸脱氢酶139饱和定点突变株的诱导表达、纯化 | 第42页 |
| ·亚磷酸脱氢酶139饱和定点突变株动力学参数测定 | 第42-43页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的固定化 | 第43-44页 |
| ·化学沉淀法制备Fe_3O_4磁性纳米颗粒 | 第43页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH固定化影响因素测定 | 第43-44页 |
| ·固定化亚磷酸脱氢酶酶学性质测定 | 第44-46页 |
| ·固定化亚磷酸脱氢酶活性的测定方法 | 第44页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的最适温度和热稳定性 | 第44页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的最适pH和pH稳定性 | 第44页 |
| ·无机离子和化学试剂对Fe_3O_4-PTDH活性的影响 | 第44-45页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的循环利用率 | 第45页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的酶动力学参数测定 | 第45-46页 |
| 3. 结果与分析 | 第46-75页 |
| ·亚磷酸脱氢酶基因ptxD合成质粒的抽提 | 第46页 |
| ·重组质粒pGEX-6p-1-ptxD的构建 | 第46-47页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的表达和纯化 | 第47-48页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的酶学性质的分析 | 第48-55页 |
| ·NADH标准曲线的绘制 | 第48-49页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的最适温度和热稳定性 | 第49-50页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的最适pH和pH耐受性 | 第50-51页 |
| ·金属离子和有机试剂对亚磷酸脱氢酶PTDH活性的影响 | 第51-52页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的酶动力学参数测定 | 第52-53页 |
| ·亚磷酸脱氢酶的三维结构模拟分析 | 第53-55页 |
| ·亚磷酸脱氢酶基因ptxD的随机突变文库的构建 | 第55-59页 |
| ·易错PCR法扩增ptxD基因 | 第55页 |
| ·ptxD随机突变文库重组质粒的检测 | 第55-57页 |
| ·ptxD基因随机突变文库突变频率的分析 | 第57页 |
| ·高催化活性突变株的筛选 | 第57页 |
| ·突变型酶的诱导表达纯化 | 第57-58页 |
| ·突变体蛋白的酶动力学参数分析 | 第58-59页 |
| ·亚磷酸脱氢酶(PTDH)139位点的饱和突变 | 第59-64页 |
| ·重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增突变片段 | 第59-60页 |
| ·Y139定点饱和突变重组质粒的检测 | 第60页 |
| ·Y139定点饱和突变株的蛋白诱导表达纯化 | 第60-62页 |
| ·Y139定点饱和突变株的酶动力学参数分析 | 第62-64页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH固定化 | 第64-69页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH固定化材—Fe_3O_4磁性纳米颗粒 | 第64-65页 |
| ·固定化材料-Fe_3O_4磁性纳米颗粒透射电镜分析 | 第65-66页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH固定化影响因素的研究分析 | 第66-69页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH傅里叶红外光谱分析 | 第69页 |
| ·固定化亚磷酸脱氢酶Fe_3O_4-PTDH酶学性质分析 | 第69-75页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的最适温度和热稳定性 | 第69-70页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的最适pH和pH稳的定性 | 第70-71页 |
| ·金属离子和有机试剂对Fe_3O_4-PTDH活性的影响 | 第71-73页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的酶动力学参数分析 | 第73页 |
| ·Fe_3O_4-PTDH的循环利用率 | 第73-75页 |
| 4、讨论 | 第75-81页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的突变体研究 | 第75-79页 |
| ·亚磷酸脱氢酶PTDH的固定化研究 | 第79-81页 |
| ·固定化载体材料——Fe_3O_4磁性纳米颗粒的制备方法 | 第79-80页 |
| ·固定化酶Fe_3O_4-PTDH的酶学性质 | 第80页 |
| ·固定化酶Fe_3O_4-PTDH的循环利用率 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-88页 |
| 研究成果 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
