| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| ·引言 | 第12-13页 |
| ·枯草芽孢杆菌蛋白质分泌方面的调控机制 | 第13-14页 |
| ·枯草芽孢杆菌的 Sec 途径 | 第13-14页 |
| ·枯草芽孢杆菌中 Tat 途径 | 第14页 |
| ·枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的分子机制 | 第14-17页 |
| ·α-淀粉酶的突变研究 | 第14页 |
| ·amyE 基因的调控机制 | 第14-16页 |
| ·amyE 的转录还受到其他调控机制 | 第16-17页 |
| ·麦芽糊精对 B.subtislis 产淀粉酶的调控机制 | 第17-18页 |
| ·λRED 同源重组基因敲除技术 | 第18-22页 |
| ·Red 同源重组技术的应用 | 第18-19页 |
| ·Red 同源重组的作用机理 | 第19-20页 |
| ·Red 同源重组系统中相关质粒 | 第20页 |
| ·同源重组辅助质粒 pKD469 | 第20页 |
| ·同源重组模板质粒 pKD49 | 第20页 |
| ·同源重组中抗性基因消除辅助质粒 pCP209 | 第20页 |
| ·Red 同源重组基因敲除的策略 | 第20-21页 |
| ·Red 同源重组的前景展望 | 第21-22页 |
| ·α-淀粉酶的应用和展望 | 第22页 |
| ·本课题立题依据和研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶差异性分析 | 第24-34页 |
| ·前言 | 第24页 |
| ·实验材料与方法 | 第24-27页 |
| ·实验菌株及培养条件 | 第24-25页 |
| ·α-淀粉酶的粗酶液制备 | 第25页 |
| ·α-淀粉酶的活力测定 | 第25页 |
| ·α-淀粉酶的硫酸铵沉淀 | 第25-26页 |
| ·B.subtilis168 和 B.subtilis1.769 分泌的α-淀粉酶初纯化 | 第26页 |
| ·B.subtilis168 和 B.subtilis1.769 产酶量变化分析 | 第26页 |
| ·不同碳源对 B.subtilis168 和 B.subtilis1.769 产α-淀粉酶的影响 | 第26页 |
| ·B.subtilis168 和 B.subtilis1.769 分泌的α-淀粉酶同工酶谱分析 | 第26-27页 |
| ·枯草芽孢杆菌调控淀粉酶基因 amyR 结构基因序列分析 | 第27页 |
| ·结果与分析 | 第27-31页 |
| ·葡萄糖标准曲线的绘制 | 第27-28页 |
| ·不同时间条件下 B.subtilis168 和 B.subtilis1.769 产酶情况分析 | 第28-29页 |
| ·不同碳源对 B.subtilis168 和 B.subtilis1.769 产酶情况的影响分析 | 第29-30页 |
| ·影响枯草芽孢杆菌菌株产酶内在影响因素的分析 | 第30-31页 |
| ·讨论 | 第31-34页 |
| 第三章 重组枯草芽孢杆菌 PaE 菌株的构建及碳代谢阻遏效应初步研究 | 第34-44页 |
| ·引言 | 第34页 |
| ·试验材料与方法 | 第34-36页 |
| ·菌株和质粒 | 第34-35页 |
| ·主要试剂和酶 | 第35页 |
| ·实验仪器 | 第35页 |
| ·主要试剂配制 | 第35-36页 |
| ·实验方法 | 第36-38页 |
| ·α-淀粉酶基因（amyE）的克隆以及重组质粒 Paxo1amyE 的构建 | 第36页 |
| ·枯草芽孢杆菌感受态制备 | 第36页 |
| ·重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶工程菌株构建及阳性克隆筛选 | 第36-38页 |
| ·实验结果与分析 | 第38-41页 |
| ·α-淀粉酶基因的克隆以及重组表达载体 PaE 的构建 | 第38-39页 |
| ·重组枯草芽孢杆菌高效分泌表达α-淀粉酶基因工程菌筛选 | 第39-40页 |
| ·重组枯草芽孢杆菌 PaE 菌株重组蛋白的 SDS-PAGE 分析结果 | 第40页 |
| ·不同碳源对重组枯草芽孢杆菌 PaE 菌株产α-淀粉酶的影响 | 第40-41页 |
| ·讨论 | 第41-44页 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌 CcpA 基因缺失突变体的制备 | 第44-58页 |
| ·引言 | 第44-45页 |
| ·材料与方法 | 第45-48页 |
| ·材料与试剂 | 第45-46页 |
| ·仪器与设备 | 第46页 |
| ·试剂的配制 | 第46-48页 |
| ·试验方法 | 第48-52页 |
| ·基因敲除的实验方法 | 第48-49页 |
| ·线性打靶片段扩增引物及鉴定引物设计 | 第49-50页 |
| ·含有 RED 重组系统相关质粒的转化及酶切验证 | 第50页 |
| ·枯草芽孢杆菌感 168 和 1.769 受态细胞制备 | 第50页 |
| ·PCR 扩增敲除体系中打靶线性片段 | 第50-51页 |
| ·重组菌株的鉴定及质粒 pKD46 的消除 | 第51页 |
| ·卡那霉素的抗性消除及敲除体 PCR 验证 | 第51-52页 |
| ·获得的敲除体突变菌株表型筛选 | 第52页 |
| ·结果与分析 | 第52-56页 |
| ·基因敲除体系相关质粒的提取及验证 | 第52-53页 |
| ·PCR 扩增同源臂得到带有卡纳抗性的线性打靶片段 | 第53-54页 |
| ·重组菌株 B.subtilis/Pkd46 阳性转化子筛选 | 第54页 |
| ·CcpA 基因敲除体验证 | 第54-56页 |
| ·小结 | 第56-58页 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌 Hprk 突变体的制备 | 第58-64页 |
| ·引言 | 第58页 |
| ·材料与方法 | 第58-59页 |
| ·材料与试剂 | 第58-59页 |
| ·仪器与设备 | 第59页 |
| ·试剂的配制 | 第59页 |
| ·实验方法 | 第59-61页 |
| ·Hprk 基因敲除的方法 | 第59页 |
| ·线性打靶片段扩增引物及鉴定引物的设计 | 第59-60页 |
| ·枯草芽孢杆菌感 168 和 1.769 受态细胞制备 | 第60页 |
| ·PCR 扩增敲除体系中线性打靶片段 | 第60-61页 |
| ·重组菌株的鉴定及质粒 pKD46 的消除 | 第61页 |
| ·卡那霉素的抗性消除及敲除体 PCR 验证 | 第61页 |
| ·结果与分析 | 第61-63页 |
| ·PCR 扩增同源臂得到带有卡纳抗性的线性打靶片段 | 第61-62页 |
| ·HprK 基因敲除及验证 | 第62-63页 |
| ·小结 | 第63-64页 |
| 第六章 突变体表型分析 | 第64-72页 |
| ·引言 | 第64页 |
| ·实验材料与方法 | 第64-66页 |
| ·菌种及培养条件 | 第64页 |
| ·不同碳源的粗酶液制备 | 第64-65页 |
| ·不同时期内突变体及野生型菌株生长量的测定 | 第65页 |
| ·不同碳源条件下α-淀粉酶活力测定 | 第65页 |
| ·不同碳源条件下突变体及野生型菌株产α-淀粉酶的同工酶谱分析 | 第65页 |
| ·不同碳源条件下突变体及野生型菌株呼吸作用变化分析 | 第65-66页 |
| ·实验结果与分析 | 第66-71页 |
| ·枯草芽孢杆菌突变体及野生型生长量的测定 | 第66-67页 |
| ·不同碳源条件下突变体及野生型菌株的产酶变化分析 | 第67-69页 |
| ·不同碳源碳源培养对枯草芽孢杆菌突变体及野生型菌株产生的同工酶谱影响 | 第69页 |
| ·突变体及野生型菌株在不同的碳源条件下呼吸作用的变化分析 | 第69-71页 |
| ·讨论 | 第71-72页 |
| 第七章 结论与展望 | 第72-74页 |
| ·枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的差异性分析 | 第72页 |
| ·重组枯草芽孢杆菌 PaE 菌株的构建及碳代谢阻遏效应初步研究 | 第72-73页 |
| ·CcpA 和 HprK 基因缺失突变体的制备及表型分析 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 致谢 | 第80-82页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第82页 |
