| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 前言 | 第17-25页 |
| 1 猪圆环病毒病国内外流行情况及研究进展 | 第17-20页 |
| ·猪圆环病毒病原学特点 | 第17页 |
| ·猪圆环病毒病国内外的流行情况 | 第17-19页 |
| ·猪圆环病毒2型分子流行病学 | 第19页 |
| ·潜在的公共卫生学意义 | 第19页 |
| ·猪圆环病毒病防治中存在的问题 | 第19-20页 |
| 2 猪圆环病毒疫苗研究进展 | 第20-21页 |
| 3 ISS增强核酸疫苗免疫原性研究进展 | 第21-22页 |
| 4 猪细胞因子分子免疫佐剂研究进展 | 第22-23页 |
| 5 壳聚糖及包被技术研究进展 | 第23页 |
| 6 本研究的创新点 | 第23-24页 |
| 7 本研究目的与意义 | 第24-25页 |
| 第一章 猪圆环病毒2型病毒株的分离鉴定 | 第25-48页 |
| 摘要 | 第25-26页 |
| 1 引言 | 第26-27页 |
| ·猪圆环病毒2型感染临床症状及病理变化概况 | 第26页 |
| ·猪圆环病毒2型基因组研究概况 | 第26页 |
| ·猪圆环病毒分离鉴定方法及目的基因的选择 | 第26-27页 |
| 2 材料 | 第27-30页 |
| ·病料 | 第27-28页 |
| ·细胞及培养基 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28-29页 |
| ·主要仪器 | 第29-30页 |
| 3 方法 | 第30-37页 |
| ·猪场猪圆环病毒2型ELISA抗体检测 | 第30页 |
| ·PCV2 ORF2基因的PCR检测 | 第30-32页 |
| ·病料的采集和处理 | 第30-31页 |
| ·病料总DNA的提取 | 第31页 |
| ·引物设计 | 第31页 |
| ·PCR扩增 | 第31-32页 |
| ·PCR产物的酶切鉴定 | 第32页 |
| ·PCV2病毒的分离培养及电镜观察 | 第32-34页 |
| ·PCV2病毒的分离 | 第32-33页 |
| ·电镜观察 | 第33-34页 |
| ·PCV2分离株全基因组序列测定与分析 | 第34-37页 |
| ·全序列引物的设计 | 第34页 |
| ·PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·PCR扩增序列片段的回收 | 第35页 |
| ·PCV2全序列T克隆的连接反应 | 第35页 |
| ·连接物的转化 | 第35-36页 |
| ·重组质粒DNA的提取 | 第36页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定及PCR检测 | 第36-37页 |
| ·序列测定 | 第37页 |
| ·序列分析 | 第37页 |
| 4 结果 | 第37-45页 |
| ·病料的PCR与ELISA检测结果 | 第37-38页 |
| ·PCV2 ORF2基因的PCR检测结果 | 第38-39页 |
| ·PCV2病毒的分离培养及电镜观察结果 | 第39页 |
| ·PCV2分离株全基因组序列测定与分析结果 | 第39-45页 |
| ·PCV2分离株的全基因组的PCR扩增 | 第39页 |
| ·PCV2全序列T克隆重组质粒的酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·PCV2分离株的全序列测定与分析 | 第40-45页 |
| 5 讨论 | 第45-47页 |
| ·猪圆环病毒分离鉴定及感染 | 第45页 |
| ·PCV2的电镜观察 | 第45-46页 |
| ·PCV2全基因组序列特征分析 | 第46-47页 |
| 6 小结 | 第47-48页 |
| 第二章 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗构建及核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒的制备 | 第48-63页 |
| 摘要 | 第48-49页 |
| 1 引言 | 第49-50页 |
| ·pVAX1表达载体的特点 | 第49页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗构建的目的基因的选择 | 第49页 |
| ·ISS分子免疫增强剂选用与效果 | 第49-50页 |
| ·核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒制备方法 | 第50页 |
| 2 材料 | 第50-51页 |
| ·菌株与质粒 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50-51页 |
| ·主要仪器及耗材 | 第51页 |
| 3 方法 | 第51-56页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗的构建 | 第51-54页 |
| ·引物设计 | 第51-52页 |
| ·PCV2 ORF2基因的PCR扩增 | 第52页 |
| ·扩增产物(目的基因)的纯化 | 第52页 |
| ·感受态细胞的准备 | 第52-53页 |
| ·酶切、连接和转化 | 第53页 |
| ·重组质粒pVAX1-ORF2的酶切鉴定 | 第53-54页 |
| ·重组质粒pVAX1-ORF2的PCR鉴定 | 第54页 |
| ·质粒pVAX1-ORF2-ISS的构建 | 第54页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒的制备 | 第54-56页 |
| ·质粒提取 | 第54-55页 |
| ·壳聚糖包裹质粒 | 第55页 |
| ·纳米粒的形态、粒径及Zeta电位测定 | 第55-56页 |
| ·凝胶阻滞分析 | 第56页 |
| 4 结果 | 第56-60页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗鉴定结果 | 第56-58页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS的PCR扩增 | 第56-57页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS的酶切鉴定和测序结果 | 第57-58页 |
| ·pVAX1-ORF2-1SS核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒的制备 | 第58-60页 |
| 5 讨论 | 第60-62页 |
| ·pVAX1优化载体的选择与常用表达载体的异同 | 第60页 |
| ·壳聚糖的特点与功能 | 第60-61页 |
| ·ISS分子免疫佐剂选用 | 第61页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗制备材料壳聚糖的选择 | 第61-62页 |
| 6 小结 | 第62-63页 |
| 第三章 猪IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达质粒鉴定及其壳聚糖纳米颗粒的制备 | 第63-72页 |
| 摘要 | 第63-64页 |
| 1 引言 | 第64页 |
| ·猪白细胞介素的选择与鉴定方法 | 第64页 |
| ·壳聚糖包被技术在细胞因子真核表达质粒中应用 | 第64页 |
| 2 材料 | 第64-65页 |
| ·菌株 | 第64-65页 |
| ·主要试剂 | 第65页 |
| ·主要仪器及耗材 | 第65页 |
| 3 方法 | 第65-67页 |
| ·猪IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达质粒的鉴定 | 第65页 |
| ·猪IL-4、IL-6、IL-6/4分子佐剂壳聚糖纳米颗粒的制备 | 第65-67页 |
| ·质粒提取 | 第65-66页 |
| ·壳聚糖包裹质粒 | 第66-67页 |
| ·纳米粒的形态、粒径及Zeta电位测定 | 第67页 |
| ·凝胶阻滞分析 | 第67页 |
| 4 结果 | 第67-69页 |
| ·猪IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达质粒的鉴定结果 | 第67-68页 |
| ·猪IL-4、IL-6、IL-6/4的分子佐剂壳聚糖纳米颗粒制备结果 | 第68-69页 |
| 5 讨论 | 第69-71页 |
| ·三种白细胞介素(IL-6、IL-4、IL6/4)的功能特点 | 第69-70页 |
| ·猪细胞因子壳聚糖纳米颗粒的制备鉴定 | 第70页 |
| ·壳聚糖纳米颗粒包被技术的优点 | 第70-71页 |
| 6 小结 | 第71-72页 |
| 第四章 猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗免疫及与猪细胞因子佐剂联合免疫猪 | 第72-98页 |
| 摘要 | 第72-73页 |
| 1 引言 | 第73-74页 |
| ·猪圆环病毒2型疫苗研究概况与免疫效应指标的选择 | 第73页 |
| ·ISS序列免疫佐剂效应研究概况 | 第73页 |
| ·猪细胞因子分子佐剂免疫效应研究概况 | 第73-74页 |
| 2 材料 | 第74页 |
| ·主要试剂 | 第74页 |
| ·主要仪器 | 第74页 |
| ·试验猪 | 第74页 |
| 3 方法 | 第74-78页 |
| ·仔猪免疫试验及分组 | 第74-75页 |
| ·免疫仔猪血清中特异性抗体含量的检测 | 第75页 |
| ·免疫仔猪T淋巴细胞亚类CD3+、CD4+、CD8+的检测 | 第75-76页 |
| ·外周血淋巴细胞的预处理 | 第75-76页 |
| ·T淋巴细胞的荧光标记 | 第76页 |
| ·FACS检测及数据处理 | 第76页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗在小鼠体内的分布的检测 | 第76-77页 |
| ·样品总DNA的抽提 | 第76-77页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS动态分布的检测 | 第77页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗的安全性检测 | 第77-78页 |
| ·组织DNA的分离纯化 | 第77-78页 |
| ·PCR检测 | 第78页 |
| 4 结果 | 第78-88页 |
| ·免疫仔猪血清中特异性抗体含量的检测结果 | 第78页 |
| ·0.25mg剂量免疫仔猪后特异性抗体检测结果 | 第78页 |
| ·0.5mg剂量免疫仔猪后特异性抗体检测结果 | 第78页 |
| ·免疫仔猪T淋巴细胞亚类CD3+、CD4+、CD8+的检测结果 | 第78-87页 |
| ·0.25mg剂量免疫仔猪后CD~3+、CD~4+、CD~8+T细胞亚类数量 | 第78-84页 |
| ·0.5mg剂量免疫仔猪后CD~3+、CD~4+、CD~8+T细胞亚类数量 | 第84-87页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗在小鼠体内的分布检测结果 | 第87页 |
| ·pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗安全性检测结果 | 第87-88页 |
| 5 讨论 | 第88-96页 |
| ·猪圆环病毒2型核酸疫苗的免疫效应 | 第88-89页 |
| ·ISS对猪圆环病毒核酸疫苗的佐剂效应 | 第89-91页 |
| ·细胞因子的佐剂效应 | 第91-94页 |
| ·免疫剂量对核酸疫苗免疫效果的影响 | 第94-95页 |
| ·核酸疫苗的分布检测结果分析 | 第95-96页 |
| ·核酸疫苗的安全性检测结果分析 | 第96页 |
| 6 小结 | 第96-98页 |
| 结论 | 第98-100页 |
| 文献综述 | 第100-137页 |
| 1 猪圆环病毒病国内外的流行情况及研究进展 | 第100-112页 |
| ·猪圆环病毒分类地位和形态 | 第100-101页 |
| ·猪圆环病毒理化特征 | 第101-102页 |
| ·猪圆环病毒的细胞培养特征 | 第102页 |
| ·猪圆环病毒的基因组特征 | 第102-103页 |
| ·猪圆环病毒ORF2基因的研究进展 | 第103-105页 |
| ·猪圆环病毒核定位序列 | 第105页 |
| ·猪圆环病毒潜在的抗原位点 | 第105-106页 |
| ·猪圆环病毒致病机理 | 第106-107页 |
| ·猪圆环病毒流行病学 | 第107-110页 |
| ·流行情况及分布 | 第107-108页 |
| ·易感动物 | 第108页 |
| ·传播方式及途径 | 第108-109页 |
| ·猪圆环病毒2型分子流行病学 | 第109页 |
| ·动物感染试验 | 第109-110页 |
| ·潜在的人畜共患病评估 | 第110页 |
| ·猪圆环病毒防制中存在的问题 | 第110-112页 |
| 2 猪圆环病毒疫苗的研究进展 | 第112-117页 |
| ·猪圆环病毒2型常规疫苗的研究概况 | 第113-114页 |
| ·PCV灭活疫苗 | 第113页 |
| ·弱毒疫苗 | 第113-114页 |
| ·猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究概况 | 第114-116页 |
| ·核酸疫苗 | 第114-115页 |
| ·重组疫苗 | 第115页 |
| ·活载体疫苗 | 第115-116页 |
| ·核酸疫苗的优点与存在问题 | 第116-117页 |
| ·核酸疫苗的优点 | 第116-117页 |
| ·核酸疫苗存在的问题 | 第117页 |
| 3 ISS增强核酸疫苗免疫原性研究进展 | 第117-122页 |
| ·ISS基序的作用机理及免疫学作用 | 第118-119页 |
| ·ISS基序对核酸疫苗免疫原性的影响 | 第119-120页 |
| ·ISS-DNA作为疫苗佐剂的应用 | 第120-121页 |
| ·ISS-DNA在DNA疫苗中的作用 | 第121页 |
| ·ISS-DNA作为核酸疫苗佐剂的发展前景 | 第121-122页 |
| 4 猪细胞因子分子免疫佐剂的研究进展 | 第122-132页 |
| ·介导天然免疫的细胞因子 | 第122-126页 |
| ·Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ) | 第123页 |
| ·白细胞介素-1(IL-1) | 第123-124页 |
| ·白细胞介素-6(IL-6) | 第124-125页 |
| ·白细胞介素-8(IL-8) | 第125页 |
| ·肿瘤坏死因子(TNF) | 第125-126页 |
| ·调节淋巴细胞活化、生长和分化的细胞因子 | 第126-129页 |
| ·白细胞介素-2(IL-2) | 第126页 |
| ·白细胞介素-4(IL-4) | 第126-127页 |
| ·白细胞介素-10(IL-10) | 第127页 |
| ·白细胞介素-12(IL-12) | 第127-128页 |
| ·白细胞介素-15(IL-15) | 第128-129页 |
| ·转化生长因子β(TGFβ) | 第129页 |
| ·活化炎性细胞的细胞因子 | 第129-131页 |
| ·干扰素-γ(IFN-γ) | 第129-130页 |
| ·白细胞介素-18(IL-18) | 第130-131页 |
| ·未成熟白细胞生长和分化的细胞因子 | 第131-132页 |
| ·粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) | 第131-132页 |
| ·白细胞介素-7(IL-7) | 第132页 |
| 5 壳聚糖及包被技术研究进展 | 第132-133页 |
| 6 猪圆环病毒2型诊断技术 | 第133-137页 |
| ·病毒的分离鉴定 | 第133-134页 |
| ·PCR技术(PCR) | 第134-135页 |
| ·病毒抗体的检测技术 | 第135-137页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA) | 第135页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第135-137页 |
| 参考文献 | 第137-149页 |
| 缩写语及中英文对照 | 第149-150页 |
| 致谢 | 第150-151页 |
| 攻读博士学位期间发表论文、出版著作、科研成果 | 第151页 |
