| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 缩略词 | 第13-14页 |
| 引言 | 第14-16页 |
| 第一章 冬虫夏草子实体和菌丝体的转录组测序及生物信息分析 | 第16-26页 |
| 1 材料 | 第16-17页 |
| 1.1 实验材料 | 第16页 |
| 1.2 实验试剂 | 第16-17页 |
| 1.3 实验仪器 | 第17页 |
| 2 方法 | 第17-19页 |
| 2.1 冬虫夏草子实体和菌丝体总RNA提取 | 第17-18页 |
| 2.1.1 冬虫夏草子实体RNA的提取 | 第17-18页 |
| 2.1.2 冬虫夏草菌丝体RNA的提取 | 第18页 |
| 2.2 冬虫夏草子实体和菌丝转录组测序及分析 | 第18-19页 |
| 2.2.1 转录组测序 | 第18-19页 |
| 2.2.2 短读序组装 | 第19页 |
| 2.2.3 测序质量评估 | 第19页 |
| 2.2.4 Unigene功能注释、GO分类和虫草素合成基因注释及差异表达分析 | 第19页 |
| 3 结果与分析 | 第19-25页 |
| 3.1 总RNA质量检测 | 第19页 |
| 3.2 转录组高通量测序质量评估 | 第19-20页 |
| 3.3 测序数据组装 | 第20-23页 |
| 3.4 Contig功能注释分析 | 第23页 |
| 3.5 虫草素生物合成途径及相关基因预测 | 第23-25页 |
| 4 讨论 | 第25-26页 |
| 第二章 冬虫夏草子实体RNRL和RNRM基因的cDNA克隆 | 第26-37页 |
| 1 材料 | 第26-27页 |
| 1.1 实验材料 | 第26页 |
| 1.2 实验试剂 | 第26页 |
| 1.3 试剂配制 | 第26-27页 |
| 1.4 实验仪器 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-32页 |
| 2.1 冬虫夏草子实体总RNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2 cDNA第一链的合成 | 第28页 |
| 2.3 冬虫夏草子实体RNRL和RNRM基因全长cDNA的克隆 | 第28-29页 |
| 2.4 PCR扩增产物的回收纯化及其与载体的连接 | 第29-30页 |
| 2.5 感受态细胞的制备与转化 | 第30-31页 |
| 2.5.1 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.5.2 感受态细胞的转化 | 第30-31页 |
| 2.6 目的基因鉴定与测序 | 第31页 |
| 2.7 序列分析与功能区分析 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-35页 |
| 3.1 总RNA提取结果 | 第32页 |
| 3.2 RNRL和RNRM基因的克隆 | 第32-33页 |
| 3.3 重组阳性质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| 3.4 RNRL和RNRM基因的cDNA序列分析 | 第34-35页 |
| 3.5 RNRL和RNRM基因编码蛋白的生物信息学分析 | 第35页 |
| 4 讨论 | 第35-37页 |
| 第三章 冬虫夏草RNRL和RNRM基因虫草素合成功能验证 | 第37-57页 |
| 1 材料 | 第37-40页 |
| 1.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 1.2 实验试剂 | 第38页 |
| 1.3 试剂配制 | 第38-40页 |
| 1.4 实验仪器 | 第40页 |
| 2 方法 | 第40-49页 |
| 2.1 RNRL和RNRM基因的克隆 | 第40-42页 |
| 2.2 目的片段、质粒的酶切和回收 | 第42-43页 |
| 2.3 目的基因与表达载体的连接 | 第43页 |
| 2.4 重组质粒的转化 | 第43页 |
| 2.5 重组质粒的鉴定 | 第43-45页 |
| 2.5.1 PCR鉴定 | 第43-44页 |
| 2.5.2 双酶切鉴定及测序 | 第44-45页 |
| 2.6 酵母感受态细胞的制备与转化 | 第45-46页 |
| 2.6.1 酵母感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| 2.6.2 酵母细胞的转化 | 第46页 |
| 2.7 酵母中重组质粒的PCR鉴定 | 第46-47页 |
| 2.8 实时荧光定量PCR | 第47-48页 |
| 2.9 WesternBlot检测 | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-56页 |
| 3.1 RNRL和RNRM基因的克隆 | 第49-50页 |
| 3.2 菌液PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 3.3 重组质粒的酶切鉴定 | 第51-52页 |
| 3.4 酵母中重组质粒的PCR鉴定 | 第52页 |
| 3.5 实时荧光定量PCR | 第52-55页 |
| 3.6 WesternBlot检测分析 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| 第四章 虫草素及虫草素合成中间产物的检测 | 第57-69页 |
| 1 材料 | 第57-58页 |
| 1.1 实验材料 | 第57页 |
| 1.2 实验试剂 | 第57页 |
| 1.3 实验仪器 | 第57-58页 |
| 2 方法 | 第58-60页 |
| 2.1 重组酵母BY4741菌液的制备 | 第58页 |
| 2.2 样品的制备 | 第58-59页 |
| 2.2.1 对照品溶液的制备 | 第58页 |
| 2.2.2 供试品溶液的制备 | 第58-59页 |
| 2.3 色谱条件 | 第59页 |
| 2.3.1 虫草素检测色谱条件 | 第59页 |
| 2.3.2 2 '-dADP检测条件 | 第59页 |
| 2.4 虫草素标准曲线的制备 | 第59页 |
| 2.5 方法学考察 | 第59-60页 |
| 2.5.1 精密度试验 | 第59页 |
| 2.5.2 稳定性试验 | 第59页 |
| 2.5.3 加样回收试验 | 第59-60页 |
| 2.6 虫草素含量测定 | 第60页 |
| 2.7 低分辨质谱检测 | 第60页 |
| 2.8 高分辨质谱检测 | 第60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-68页 |
| 3.1 虫草素标准曲线 | 第60页 |
| 3.2 精密度试验 | 第60-61页 |
| 3.3 稳定性试验 | 第61页 |
| 3.4 加样回收试验 | 第61-62页 |
| 3.5 虫草素含量测定结果与分析 | 第62-64页 |
| 3.6 低分辨质谱检测 | 第64-67页 |
| 3.7 高分辨质谱检测 | 第67-68页 |
| 4 讨论 | 第68-69页 |
| 创新点 | 第69-70页 |
| 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-74页 |
| 文献综述 真菌核苷类抗生素研究进展 | 第74-88页 |
| 1 真菌核苷类抗生素的分类 | 第74-76页 |
| 2 真菌核苷类抗生素生物合成研究进展 | 第76-83页 |
| 2.1 多氧霉素生物合成研究进展 | 第76-78页 |
| 2.2 米多霉素生物合成研究进展 | 第78-80页 |
| 2.3 虫草素生物合成研究进展 | 第80-83页 |
| 2.3.1 菌株诱变和筛选 | 第80页 |
| 2.3.2 培养基优化 | 第80-81页 |
| 2.3.3 培养条件优化 | 第81页 |
| 2.3.4 虫草素生物合成相关基因的研究 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果 | 第89-90页 |
