| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第14-20页 |
| 1.1 脂肪酶的简介 | 第14页 |
| 1.2 脂肪酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.2.1 脂肪酶在食品工业中的应用 | 第14页 |
| 1.2.2 脂肪酶在医药行业的应用 | 第14-15页 |
| 1.2.3 脂肪酶在其它方面的应用 | 第15页 |
| 1.3 脂肪酶的结构特点 | 第15-16页 |
| 1.4 脂肪酶的催化机制 | 第16-17页 |
| 1.5 偏甘油酯脂肪酶 | 第17页 |
| 1.5.1 偏甘油酯脂肪酶重要的生理功能 | 第17页 |
| 1.5.2 偏甘油酯脂肪酶的工业应用价值 | 第17页 |
| 1.6 蛋白质晶体学 | 第17-18页 |
| 1.7 研究背景和意义及研究内容 | 第18-20页 |
| 1.7.1 研究背景和意义 | 第18-19页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第19页 |
| 1.7.3 技术路线 | 第19-20页 |
| 第二章 AOL的酶学性质表征 | 第20-34页 |
| 2.1 引言 | 第20页 |
| 2.2 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.2.1 主要材料与试剂 | 第20页 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 | 第20-21页 |
| 2.2.3 培养基及溶液配制 | 第21-22页 |
| 2.3 实验方法 | 第22-27页 |
| 2.3.1 AOL粗酶液的制备 | 第22页 |
| 2.3.2 粗酶液的处理及蛋白的初步纯化 | 第22-23页 |
| 2.3.3 蛋白浓度的测定 | 第23页 |
| 2.3.4 酶活力的测定 | 第23页 |
| 2.3.5 AOL最适温度及温度耐受性的测定 | 第23-24页 |
| 2.3.6 AOL最适pH及pH耐受性的测定 | 第24页 |
| 2.3.7 金属离子、表面活性剂和有机溶剂对AOL酶活力的影响 | 第24页 |
| 2.3.8 AOL冻干粉的制备 | 第24页 |
| 2.3.9 AOL对醇的选择性 | 第24-25页 |
| 2.3.10 AOL对脂肪酸的选择性 | 第25-26页 |
| 2.3.11 高效液相色谱法(HPLC)测定甘油酯和脂肪酸含量 | 第26页 |
| 2.3.12 气相色谱法(GC)测定脂肪酸组成 | 第26-27页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第27-33页 |
| 2.4.1 AOL的表达与纯化 | 第27-28页 |
| 2.4.2 AOL最适温度及温度耐受性 | 第28-29页 |
| 2.4.3 AOL最适pH及pH耐受性 | 第29页 |
| 2.4.4 金属离子、表面活性剂和有机溶剂对AOL酶活力的影响 | 第29-31页 |
| 2.4.5 AOL对醇的选择性 | 第31-33页 |
| 2.4.6 AOL对脂肪酸的选择性 | 第33页 |
| 2.5 本章小结 | 第33-34页 |
| 第三章 AOL在大肠杆菌中高效表达、纯化 | 第34-47页 |
| 3.1 引言 | 第34页 |
| 3.2 实验材料 | 第34-36页 |
| 3.2.1 主要材料与试剂 | 第34-35页 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 | 第35页 |
| 3.2.3 培养基及溶液配制 | 第35-36页 |
| 3.3 实验方法 | 第36-41页 |
| 3.3.1 AOL基因序列的分析和引物设计 | 第36页 |
| 3.3.2 表达载体pFL-B13cl-AOL的构建 | 第36-40页 |
| 3.3.3 重组表达菌株pFL-B13cl-AOL/SHuffleT7的构建 | 第40页 |
| 3.3.4 重组表达菌株pFL-B13cl-AOL/SHuffleT7的扩大培养 | 第40页 |
| 3.3.5 重组AOL的纯化 | 第40-41页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第41-45页 |
| 3.4.1 AOL基因序列分析和引物设计 | 第41-42页 |
| 3.4.2 表达载体pFL-B13cl-AOL的构建 | 第42-43页 |
| 3.4.3 重组表达菌株pFL-B13cl-AOL/SHuffleT7的鉴定 | 第43-44页 |
| 3.4.4 重组AOL的纯化 | 第44-45页 |
| 3.5 本章小结 | 第45-47页 |
| 第四章 AOL的晶体结构解析 | 第47-56页 |
| 4.1 引言 | 第47页 |
| 4.2 实验材料 | 第47页 |
| 4.2.1 主要材料与试剂 | 第47页 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 | 第47页 |
| 4.2.3 溶液配制 | 第47页 |
| 4.3 实验方法 | 第47-49页 |
| 4.3.1 AOL的凝胶过滤层析纯化 | 第47-48页 |
| 4.3.2 AOL蛋白结晶浓度的筛选 | 第48页 |
| 4.3.3 AOL结晶条件的筛选和优化 | 第48-49页 |
| 4.3.4 AOL衍射数据的收集及处理 | 第49页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第49-54页 |
| 4.4.1 AOL的凝胶过滤层析纯化 | 第49-50页 |
| 4.4.2 AOL结晶条件的筛选和优化 | 第50页 |
| 4.4.3 AOL晶体衍射数据的收集及处理 | 第50-52页 |
| 4.4.4 AOL晶体结构的分析 | 第52-53页 |
| 4.4.5 AOL与其他脂肪酶的比较 | 第53-54页 |
| 4.5 本章小结 | 第54-56页 |
| 第五章 AOL突变体的表达、纯化及酶学性质研究 | 第56-76页 |
| 5.1 引言 | 第56页 |
| 5.2 实验材料 | 第56-57页 |
| 5.2.1 主要材料与试剂 | 第56页 |
| 5.2.2 主要仪器与设备 | 第56-57页 |
| 5.2.3 培养基及溶液配制 | 第57页 |
| 5.3 实验方法 | 第57-64页 |
| 5.3.1 AOL突变位点选取 | 第57页 |
| 5.3.2 引物设计 | 第57页 |
| 5.3.3 pGAPZαA-AOL突变型表达载体的构建 | 第57-60页 |
| 5.3.4 AOL突变体毕赤酵母X-33重组表达菌株的构建 | 第60-61页 |
| 5.3.5 AOL突变体蛋白粗酶液的制备 | 第61-62页 |
| 5.3.6 AOL突变体蛋白粗酶液的处理及蛋白的纯化 | 第62页 |
| 5.3.7 AOL突变体蛋白浓度的测定 | 第62页 |
| 5.3.8 AOL突变体最适温度和最适pH的测定 | 第62页 |
| 5.3.9 AOL野生型和突变体的热稳定性 | 第62-63页 |
| 5.3.10 AOL野生型和突变体动力学参数的测定 | 第63页 |
| 5.3.11 AOL野生型和突变体对甘油二酯的水解活力测定 | 第63-64页 |
| 5.3.12 AOL突变体冻干粉的制备 | 第64页 |
| 5.3.13 AOL野生型和突变体酯化活力测定 | 第64页 |
| 5.3.14 V269D对脂肪酸的选择性 | 第64页 |
| 5.3.15 同源建模和分子对接 | 第64页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第64-75页 |
| 5.4.1 引物设计 | 第64-65页 |
| 5.4.2 AOL突变体基因的克隆 | 第65-66页 |
| 5.4.3 AOL突变体蛋白的纯化 | 第66页 |
| 5.4.4 AOL突变体的最适温度和pH | 第66-69页 |
| 5.4.5 AOL野生型和突变体的热稳定性 | 第69页 |
| 5.4.6 AOL突变体的动力学参数 | 第69-70页 |
| 5.4.7 AOL突变体对1,3-二油酸甘油酯的水解活力 | 第70-71页 |
| 5.4.8 AOL野生型和突变体的酯化活力 | 第71-72页 |
| 5.4.9 V269D对脂肪酸的选择性 | 第72页 |
| 5.4.10 V269位点对AOL活力调控的生物信息学分析 | 第72-75页 |
| 5.5 本章小结 | 第75-76页 |
| 结论与展望 | 第76-78页 |
| 一、结论 | 第76-77页 |
| 二、创新点 | 第77页 |
| 三、展望 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-85页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 附录 | 第87页 |
