| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1.1 手性药物的概述 | 第12-13页 |
| 1.2 手性药物制备的主要方法 | 第13-16页 |
| 1.2.1 从天然物中提取 | 第13页 |
| 1.2.2 化学合成法 | 第13-15页 |
| 1.2.3 生物合成法 | 第15-16页 |
| 1.3 具有光学活性的β-羟基酯的应用 | 第16页 |
| 1.4 手性CHBE的制备 | 第16-20页 |
| 1.4.1 COBE不对称合成法 | 第17-18页 |
| 1.4.2 外消旋CHBE的手性拆分 | 第18-20页 |
| 1.5 微生物酯酶概述 | 第20-21页 |
| 1.6 本论文的研究背景、内容及意义 | 第21-23页 |
| 1.6.1 选题意义 | 第21-22页 |
| 1.6.2 研究思路及技术路线 | 第22-23页 |
| 第二章 巨大芽胞杆菌WZ009胞内酯酶的纯化研究 | 第23-38页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-26页 |
| 2.2.1 菌种 | 第23页 |
| 2.2.2 培养基 | 第23-24页 |
| 2.2.3 缓冲液 | 第24页 |
| 2.2.4 试剂与材料 | 第24-25页 |
| 2.2.5 主要仪器 | 第25-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-31页 |
| 2.3.1 菌种培养 | 第26页 |
| 2.3.2 酯酶的分离纯化方法 | 第26-28页 |
| 2.3.2.1 粗酶液的制备 | 第26页 |
| 2.3.2.2 离子交换柱层析 | 第26-27页 |
| 2.3.2.3 疏水柱层析 | 第27页 |
| 2.3.2.4 羟基磷灰石层析 | 第27-28页 |
| 2.3.2.5 活性染色实验 | 第28页 |
| 2.3.3 蛋白质浓度测定 | 第28-29页 |
| 2.3.4 酶活力测定 | 第29-30页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE对酯酶纯度的检测和分子量确定 | 第30页 |
| 2.3.6 蛋白质电转膜及N-端序列测定 | 第30-31页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第31-36页 |
| 2.4.1 胞内酯酶的分离和纯化 | 第31-36页 |
| 2.4.1.1 粗酶液的制备 | 第31页 |
| 2.4.1.2 DEAE-Sepharose FF层析 | 第31-32页 |
| 2.4.1.3 Phenyl Sepharose 6FF层析 | 第32-33页 |
| 2.4.1.4 羟基磷灰石层析 | 第33-34页 |
| 2.4.1.5 酯酶纯度鉴定及分子量测定 | 第34-35页 |
| 2.4.1.6 活染实验 | 第35-36页 |
| 2.4.2 酯酶电转膜及N-端序列测定 | 第36页 |
| 2.5 本章小结与讨论 | 第36-38页 |
| 第三章 巨大芽胞杆菌WZ009酯酶克隆、表达及结构分析 | 第38-65页 |
| 3.1 引言 | 第38页 |
| 3.2 实验材料 | 第38-41页 |
| 3.2.1 菌种及质粒载体 | 第38-39页 |
| 3.2.2 试剂与材料 | 第39页 |
| 3.2.3 培养基 | 第39页 |
| 3.2.4 缓冲液及洗脱液 | 第39-40页 |
| 3.2.5 主要仪器 | 第40-41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-46页 |
| 3.3.1 菌种培养 | 第41页 |
| 3.3.2 引物设计 | 第41页 |
| 3.3.3 基因组的提取 | 第41页 |
| 3.3.4 目的基因PCR扩增 | 第41-42页 |
| 3.3.5 重组表达载体pEASY-E1-est和pEASY-E2-est的构建及鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.6 重组质粒pEASY-E1-est和pEASY-E2-est的表达 | 第43-44页 |
| 3.3.7 重组蛋白的纯化 | 第44页 |
| 3.3.8 重组酯酶酶学性质研究 | 第44-46页 |
| 3.3.8.1 底物特异性 | 第44页 |
| 3.3.8.2 pH对重组酯酶活力影响 | 第44-45页 |
| 3.3.8.3 温度对重组酯酶活力影响 | 第45页 |
| 3.3.8.4 金属离子对酶活力的影响 | 第45页 |
| 3.3.8.5 有机溶剂对酶活力的影响 | 第45页 |
| 3.3.8.6 表面活性剂及抑制剂对酶活力的影响 | 第45-46页 |
| 3.3.8.7 重组酯酶拆分外消旋CHBE动力学常数测定 | 第46页 |
| 3.3.9 重组酯酶的序列分析及同源建模 | 第46页 |
| 3.4 实验结果 | 第46-63页 |
| 3.4.1 基因组提取及目的基因PCR扩增 | 第46-47页 |
| 3.4.2 阳性重组子鉴定 | 第47-49页 |
| 3.4.3 测序鉴定 | 第49-51页 |
| 3.4.4 重组蛋白的诱导表达 | 第51-53页 |
| 3.4.5 重组蛋白Ni2+亲和层析纯化 | 第53-54页 |
| 3.4.6 重组酯酶酶学性质研究 | 第54-61页 |
| 3.4.6.1 底物特异性 | 第54-55页 |
| 3.4.6.2 pH对酯酶活力及稳定性的影响 | 第55-56页 |
| 3.4.6.3 温度对酯酶活力及稳定性的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.6.4 金属离子对酯酶活力的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.6.5 有机溶剂对酯酶活力的影响 | 第58-59页 |
| 3.4.6.6 表面活性剂及抑制剂对酯酶活力的影响 | 第59-60页 |
| 3.4.6.7 重组酯酶拆分外消旋CHBE动力学常数测定 | 第60-61页 |
| 3.4.7 est序列比对分析 | 第61-63页 |
| 3.5 本章小结及讨论 | 第63-65页 |
| 第四章 重组菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-est不对称水解CHBE反应条件的优化 | 第65-78页 |
| 4.1 前言 | 第65页 |
| 4.2 实验材料 | 第65-67页 |
| 4.2.1 菌种 | 第65-66页 |
| 4.2.2 试剂 | 第66页 |
| 4.2.3 培养基 | 第66页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第66-67页 |
| 4.3 实验方法 | 第67-69页 |
| 4.3.1 酶催化条件优化 | 第67-68页 |
| 4.3.1.1 pH对催化反应的影响 | 第67页 |
| 4.3.1.2 温度对酶催化反应的影响 | 第67页 |
| 4.3.1.3 底物浓度对酶催化反应的影响 | 第67-68页 |
| 4.3.2 高底物浓度酶催化的实现 | 第68-69页 |
| 4.3.2.1 最佳活性炭量 | 第68页 |
| 4.3.2.2 抑制机制探索 | 第68-69页 |
| 4.3.2.3 高底物浓度的催化 | 第69页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第69-77页 |
| 4.4.1 生物法拆分 4-氯3羟基丁酸乙酯条件研究 | 第69-72页 |
| 4.4.1.1 pH对催化反应的影响 | 第69-70页 |
| 4.4.1.2 温度对催化反应的影响 | 第70-71页 |
| 4.4.1.3 底物浓度对催化反应的影响 | 第71-72页 |
| 4.4.2 高底物浓度催化的实现 | 第72-77页 |
| 4.4.2.1 最佳活性炭量 | 第72-73页 |
| 4.4.2.2 抑制机制探索 | 第73-75页 |
| 4.4.2.3 高底物浓度的催化 | 第75-77页 |
| 4.5 小结与讨论 | 第77-78页 |
| 第五章 结论与展望 | 第78-81页 |
| 5.1 结论 | 第78-80页 |
| 5.2 展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第87页 |
