| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-28页 |
| 1.1 手性环氧氯丙烷 | 第12-18页 |
| 1.1.1 手性环氧化合物 | 第12页 |
| 1.1.2 手性环氧氯丙烷 | 第12-14页 |
| 1.1.3 手性环氧氯丙烷的合成 | 第14-15页 |
| 1.1.3.1 化学拆分法制备手性环氧氯丙烷 | 第14-15页 |
| 1.1.4 生物催化法合成手性环氧氯丙烷 | 第15-18页 |
| 1.1.4.1 生物不对称合成法 | 第15-16页 |
| 1.1.4.2 生物拆分法 | 第16-18页 |
| 1.2 环氧化物水解酶的分子改造 | 第18-20页 |
| 1.2.1 环氧化物水解酶的概述 | 第18-19页 |
| 1.2.2 微生物环氧化物水解酶的结构与催化机制 | 第19-20页 |
| 1.3 蛋白质分子改造的方法 | 第20-24页 |
| 1.3.1 易错PCR | 第21页 |
| 1.3.2. DNA Shuffling | 第21-22页 |
| 1.3.3 定点突变 | 第22-23页 |
| 1.3.4 定点饱和突变方法 | 第23页 |
| 1.3.5 迭代饱和突变技术 | 第23-24页 |
| 1.4 环氧化物水解酶改造的成功案例 | 第24-26页 |
| 1.4.1 定向进化提高EH的活性 | 第24-25页 |
| 1.4.2 定向进化提高酶的立体选择性 | 第25-26页 |
| 1.5 本论文的研究意义与内容 | 第26-28页 |
| 1.5.1 本论文研究意义 | 第26页 |
| 1.5.2 本论文的研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 Agrobacterium radiobacter EH的分子改造 | 第28-44页 |
| 2.1 引言 | 第28-29页 |
| 2.2 材料与方法 | 第29-37页 |
| 2.2.1 主要工具酶与试剂 | 第29页 |
| 2.2.2 菌种与载体 | 第29页 |
| 2.2.3 培养基 | 第29页 |
| 2.2.4 实验仪器设备 | 第29-30页 |
| 2.2.5 环氧化物水解酶的分子改造 | 第30-34页 |
| 2.2.5.1 大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.5.2 质粒提取 | 第31页 |
| 2.2.5.3 突变文库的构建 | 第31-33页 |
| 2.2.5.4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 | 第33-34页 |
| 2.2.5.5 DpnI酶切 | 第34页 |
| 2.2.5.6 酶切产物的转化 | 第34页 |
| 2.2.6 菌落PCR | 第34-35页 |
| 2.2.7 96 孔板培养与初筛 | 第35页 |
| 2.2.8 复筛验证 | 第35-36页 |
| 2.2.9 检测方法 | 第36页 |
| 2.2.10 酶活与比酶活 | 第36-37页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第37-42页 |
| 2.3.1 分子对接与饱和突变位点的选择 | 第37-38页 |
| 2.3.2 全质粒PCR电泳图 | 第38页 |
| 2.3.3 阳性克隆子的鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.4 I108L,C248I,I219L定点突变及其催化拆分ECH的研究 | 第39-40页 |
| 2.3.5 饱和突变库的构建与筛选 | 第40-42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-44页 |
| 第三章 突变体酶的酶学性质研究 | 第44-56页 |
| 3.1 前言 | 第44页 |
| 3.2 材料与方法 | 第44-47页 |
| 3.2.1 材料 | 第44-45页 |
| 3.2.1.1 菌种 | 第44页 |
| 3.2.1.2 培养基 | 第44-45页 |
| 3.2.1.3 主要仪器 | 第45页 |
| 3.2.2 微生物培养 | 第45页 |
| 3.2.3 突变体酶的分离纯化 | 第45-46页 |
| 3.2.4 蛋白质浓度的测定 | 第46页 |
| 3.2.5 突变体酶的酶学性质 | 第46-47页 |
| 3.2.6 突变体酶动力学参数的测定 | 第47页 |
| 3.2.7 分析方法 | 第47页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第47-55页 |
| 3.3.1 突变体酶的分离纯化 | 第47-48页 |
| 3.3.2 pH对酶活力的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.3 温度对酶活力的影响 | 第49-50页 |
| 3.3.4 突变体酶在 50℃下的热稳定性 | 第50-51页 |
| 3.3.5 突变体酶拆分rac-ECH获得(R)-ECH的研究 | 第51-52页 |
| 3.3.6 酶促反应动力学参数测定 | 第52-53页 |
| 3.3.7 结构与机理分析 | 第53-55页 |
| 3.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第四章 突变体T247K/I108L/D131S全细胞催化合成(R)-ECH条件的研究 | 第56-66页 |
| 4.1 前言 | 第56页 |
| 4.2 材料与方法 | 第56-57页 |
| 4.2.1 菌株与培养基 | 第56-57页 |
| 4.2.2 主要实验仪器 | 第57页 |
| 4.2.3 静息细胞的制备 | 第57页 |
| 4.2.4 静息细胞转化条件的优化 | 第57页 |
| 4.2.5 检测方法 | 第57页 |
| 4.2.6 酶活与比酶活 | 第57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-65页 |
| 4.3.1 pH对菌体催化环氧氯丙烷的影响 | 第57-58页 |
| 4.3.2 温度对菌体催化环氧氯丙烷的影响 | 第58-59页 |
| 4.3.3 菌体添加量对菌体催化环氧氯丙烷的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.4 底物浓度对催化反应的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.5 产物 3-氯-1,2-丙二醇浓度对催化反应的影响 | 第61-63页 |
| 4.3.6 表面活性剂对催化反应的影响 | 第63-64页 |
| 4.3.7 全细胞催化拆分环氧氯丙烷的进程曲线 | 第64-65页 |
| 4.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 第五章 结论与展望 | 第66-70页 |
| 5.1 结论 | 第66-68页 |
| 5.2 展望 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-75页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
