| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 拉丁文 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-31页 |
| 1.1 副溶血弧菌的特征与流行现状 | 第16-17页 |
| 1.1.1 副溶血弧菌的特征 | 第16页 |
| 1.1.2 副溶血弧菌的流行现状 | 第16-17页 |
| 1.2 副溶血弧菌检测方法研究现状 | 第17-26页 |
| 1.2.1 传统检测方法 | 第17-19页 |
| 1.2.1.1 增菌 | 第18页 |
| 1.2.1.2 选择性平板分离 | 第18页 |
| 1.2.1.3 初步鉴定 | 第18页 |
| 1.2.1.4 确定鉴定 | 第18-19页 |
| 1.2.1.5 血清学分型 | 第19页 |
| 1.2.1.6 神奈川试验 | 第19页 |
| 1.2.2 免疫学检测方法 | 第19-22页 |
| 1.2.2.1 酶联免疫吸附法(ELISA) | 第19-21页 |
| 1.2.2.2 免疫磁珠法(IMB) | 第21页 |
| 1.2.2.3 免疫荧光法(IFA) | 第21-22页 |
| 1.2.2.4 免疫传感器法(IS) | 第22页 |
| 1.2.3 分子生物学检测方法 | 第22-26页 |
| 1.2.3.1 普通PCR(PCR) | 第22-23页 |
| 1.2.3.2 多重PCR(MPCR) | 第23-24页 |
| 1.2.3.3 实时荧光定量PCR(RT-PCR) | 第24页 |
| 1.2.3.4 基因芯片(Gene Chip) | 第24-25页 |
| 1.2.3.5 DNA杂交(DNA Hybridization) | 第25页 |
| 1.2.3.6 环介导等温扩增(LAMP) | 第25-26页 |
| 1.2.4 仪器检测法 | 第26页 |
| 1.2.4.1 API细菌鉴定系统(API) | 第26页 |
| 1.2.4.2 全自动微生物鉴定/药敏分析系统(VITEK) | 第26页 |
| 1.2.4.3 多参数免疫分析仪(VIDAS) | 第26页 |
| 1.3 胶体金 | 第26-30页 |
| 1.3.1 胶体金的来源 | 第26-27页 |
| 1.3.2 免疫胶体金的特性 | 第27页 |
| 1.3.3 免疫胶体金的应用 | 第27-30页 |
| 1.3.3.1 电镜检测 | 第27-28页 |
| 1.3.3.2 免疫胶体金传感器 | 第28页 |
| 1.3.3.3 斑点金免疫渗滤 | 第28-29页 |
| 1.3.3.4 胶体金免疫层析 | 第29-30页 |
| 1.4 本研究的目的意义 | 第30-31页 |
| 第二章 抗副溶血弧菌多克隆抗体的制备与纯化 | 第31-42页 |
| 2.1 材料 | 第31-34页 |
| 2.1.1 菌株来源 | 第31页 |
| 2.1.2 实验动物 | 第31页 |
| 2.1.3 培养基 | 第31页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第32页 |
| 2.1.6 ELISA试剂的配制 | 第32-33页 |
| 2.1.7 蛋白质含量试剂的配制 | 第33页 |
| 2.1.8 SDS-PAGE缓冲液的配制 | 第33-34页 |
| 2.1.9 动物饲养与处理 | 第34页 |
| 2.2 方法 | 第34-37页 |
| 2.2.1 多克隆抗体的制备 | 第34-35页 |
| 2.2.1.1 菌种的活化 | 第34页 |
| 2.2.1.2 抗原的制备 | 第34页 |
| 2.2.1.3 免疫方案 | 第34-35页 |
| 2.2.1.4 多克隆抗体的产生进程 | 第35页 |
| 2.2.1.5 间接ELISA检测多克隆抗体的效价 | 第35页 |
| 2.2.2 多克隆抗体的纯化与鉴定 | 第35-37页 |
| 2.2.2.1 辛酸-硫酸铵沉淀盐析法 | 第35-36页 |
| 2.2.2.2 多克隆抗体蛋白质含量的测定 | 第36页 |
| 2.2.2.3 多克隆抗体纯度及分子量测定 | 第36-37页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第37-40页 |
| 2.3.1 副溶血弧菌的形态 | 第37页 |
| 2.3.2 多克隆抗体的产生进程 | 第37-38页 |
| 2.3.3 间接ELISA检测多克隆抗体的效价 | 第38-39页 |
| 2.3.4 多克隆抗体蛋白质含量的测定 | 第39页 |
| 2.3.5 多克隆抗体纯度及分子量的测定 | 第39-40页 |
| 2.4 讨论 | 第40-41页 |
| 2.4.1 免疫方案 | 第40页 |
| 2.4.2 抗体纯化方法 | 第40-41页 |
| 2.5 小结 | 第41-42页 |
| 第三章 抗副溶血弧菌多克隆抗体间接ELISA条件的优化 | 第42-54页 |
| 3.1 材料 | 第42-43页 |
| 3.1.1 菌株来源 | 第42-43页 |
| 3.1.2 抗体 | 第43页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第43页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第43页 |
| 3.1.5 ELISA试剂的配制 | 第43页 |
| 3.2 方法 | 第43-45页 |
| 3.2.1 间接ELISA最佳条件确定 | 第43-45页 |
| 3.2.1.1 抗原和抗体最佳浓度的确定 | 第43-44页 |
| 3.2.1.2 封闭条件的选择 | 第44页 |
| 3.2.1.3 一抗反应时间的确定 | 第44页 |
| 3.2.1.4 酶标二抗的浓度和反应时间的确定 | 第44页 |
| 3.2.1.5 底物显色时间的确定 | 第44页 |
| 3.2.1.6 包被条件的选择 | 第44-45页 |
| 3.2.2 特异性 | 第45页 |
| 3.2.3 检测限 | 第45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-52页 |
| 3.3.1 间接ELISA最佳条件确定 | 第45-50页 |
| 3.3.1.1 抗原和抗体最佳浓度的确定 | 第45-46页 |
| 3.3.1.2 封闭条件的选择 | 第46-47页 |
| 3.3.1.3 一抗反应时间的确定 | 第47页 |
| 3.3.1.4 酶标二抗的浓度和反应时间的确定 | 第47-49页 |
| 3.3.1.5 底物显色时间的确定 | 第49页 |
| 3.3.1.6 包被条件的选择 | 第49-50页 |
| 3.3.2 特异性 | 第50-52页 |
| 3.3.3 检测限 | 第52页 |
| 3.4 讨论 | 第52-53页 |
| 3.4.1 封闭条件的选择 | 第52-53页 |
| 3.5 小结 | 第53-54页 |
| 第四章 抗副溶血弧菌单克隆抗体的制备与纯化 | 第54-67页 |
| 4.1 材料 | 第54-57页 |
| 4.1.1 菌株来源 | 第54页 |
| 4.1.2 实验细胞 | 第54页 |
| 4.1.3 实验动物 | 第54页 |
| 4.1.4 培养液及主要试剂 | 第54-55页 |
| 4.1.5 主要仪器 | 第55页 |
| 4.1.6 细胞融合培养液及主要试剂配制 | 第55-56页 |
| 4.1.7 ELISA试剂的配制 | 第56页 |
| 4.1.8 SDS-PAGE缓冲液的配制 | 第56-57页 |
| 4.2 方法 | 第57-62页 |
| 4.2.1 菌株的活化和抗原的制备 | 第57页 |
| 4.2.2 免疫方案 | 第57页 |
| 4.2.3 筛选方法的建立 | 第57-58页 |
| 4.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养 | 第58页 |
| 4.2.5 饲养细胞的制备 | 第58页 |
| 4.2.6 SP2/0骨髓瘤细胞的制备 | 第58-59页 |
| 4.2.7 免疫脾细胞的制备 | 第59页 |
| 4.2.8 细胞融合 | 第59页 |
| 4.2.9 间接ELISA检测杂交瘤细胞上清 | 第59-60页 |
| 4.2.10 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法) | 第60页 |
| 4.2.11 杂交瘤细胞的冻存 | 第60页 |
| 4.2.12 单克隆抗体的大量制备 | 第60页 |
| 4.2.13 单克隆抗体的纯化 | 第60-61页 |
| 4.2.14 间接ELISA检测单克隆抗体的效价 | 第61页 |
| 4.2.15 单克隆抗体纯度及分子量的测定 | 第61-62页 |
| 4.3 结果与分析 | 第62-66页 |
| 4.3.1 免疫小鼠抗体效价的测定 | 第62页 |
| 4.3.2 细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第62-64页 |
| 4.3.3 杂交瘤细胞的克隆化培养与细胞系的建立 | 第64页 |
| 4.3.4 单克隆抗体大量制备和纯化效价的测定 | 第64页 |
| 4.3.5 间接ELISA检测单克隆抗体的效价 | 第64-65页 |
| 4.3.6 单克隆抗体纯度及分子量的测定 | 第65-66页 |
| 4.4 讨论 | 第66页 |
| 4.4.1 动物免疫 | 第66页 |
| 4.4.2 骨髓瘤细胞的准备 | 第66页 |
| 4.4.3 单克隆抗体的克隆化 | 第66页 |
| 4.5 小结 | 第66-67页 |
| 第五章 胶体金和金标抗体的制备 | 第67-75页 |
| 5.1 材料 | 第67-68页 |
| 5.1.1 主要试剂 | 第67页 |
| 5.1.2 主要仪器 | 第67页 |
| 5.1.3 溶液的配制 | 第67-68页 |
| 5.2 方法 | 第68-69页 |
| 5.2.1 胶体金的制备 | 第68页 |
| 5.2.2 胶体金的粒径 | 第68页 |
| 5.2.3 胶体金标记抗体最佳浓度 | 第68页 |
| 5.2.4 金标抗体复合物的制备 | 第68-69页 |
| 5.3 结果 | 第69-74页 |
| 5.3.1 胶体金的粒径 | 第69-71页 |
| 5.3.2 抗体最佳偶联浓度 | 第71-72页 |
| 5.3.3 金标抗体复合物的性质 | 第72-74页 |
| 5.4 讨论 | 第74页 |
| 5.4.1 胶体金的制备 | 第74页 |
| 5.4.2 胶体金制备的环境、试剂和水质 | 第74页 |
| 5.4.3 胶体金制备的仪器 | 第74页 |
| 5.5 小结 | 第74-75页 |
| 第六章 副溶血弧菌免疫层析试纸条的制备及研究 | 第75-86页 |
| 6.1 材料 | 第75-76页 |
| 6.1.1 主要试剂 | 第75页 |
| 6.1.2 免疫层析试剂的配制 | 第75页 |
| 6.1.3 试纸条的材料 | 第75-76页 |
| 6.2 方法 | 第76-77页 |
| 6.2.1 玻璃纤维素膜的选择 | 第76页 |
| 6.2.2 硝酸纤维素膜的选择 | 第76页 |
| 6.2.3 控制线抗体浓度的选择 | 第76页 |
| 6.2.4 检测线抗体浓度的选择 | 第76页 |
| 6.2.5 试纸条的判定标准 | 第76-77页 |
| 6.2.6 试纸条的特异性 | 第77页 |
| 6.2.7 人工模拟实验 | 第77页 |
| 6.2.8 试纸条的检测限 | 第77页 |
| 6.2.9 试纸条的稳定性 | 第77页 |
| 6.3 结果 | 第77-84页 |
| 6.3.1 玻璃纤维素膜的选择 | 第77-78页 |
| 6.3.2 硝酸纤维素膜的选择 | 第78页 |
| 6.3.3 控制线抗体浓度的选择 | 第78-79页 |
| 6.3.4 检测线抗体浓度的选择 | 第79页 |
| 6.3.5 试纸条的特异性 | 第79-82页 |
| 6.3.6 人工模拟实验 | 第82页 |
| 6.3.7 试纸条的检测限 | 第82-83页 |
| 6.3.8 试纸条的稳定性 | 第83-84页 |
| 6.4 讨论 | 第84-85页 |
| 6.4.1 玻璃纤维素膜的选取 | 第84页 |
| 6.4.2 硝酸纤维素膜的选择 | 第84-85页 |
| 6.5 小结 | 第85-86页 |
| 第七章 结论 | 第86-88页 |
| 7.1 研究总结 | 第86-87页 |
| 7.2 创新 | 第87页 |
| 7.3 研究展望 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 附录 | 第98页 |
