| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第11-12页 |
| 1. 前言 | 第12-17页 |
| 1.1 猪链球菌流行病学背景 | 第12页 |
| 1.2 细菌的金属离子代谢及摄取方式 | 第12-13页 |
| 1.3 细菌中金属离子代谢的调控机制 | 第13-15页 |
| 1.4 转录调控机制研究方法 | 第15-17页 |
| 2. 研究的目的与意义 | 第17-18页 |
| 3. 实验材料与方法 | 第18-37页 |
| 3.1 实验材料 | 第18-26页 |
| 3.1.1 菌株、质粒和培养条件 | 第18-20页 |
| 3.1.2 动物和细胞 | 第20页 |
| 3.1.3 主要药品和试剂 | 第20-21页 |
| 3.1.4 主要使用仪器 | 第21页 |
| 3.1.5 培养基、抗生素及其它试剂的配制 | 第21-25页 |
| 3.1.6 引物 | 第25-26页 |
| 3.2 实验方法 | 第26-37页 |
| 3.2.1 猪链球菌2型的活化及基因组的提取 | 第26页 |
| 3.2.2 PCR扩增 | 第26页 |
| 3.2.3 DNA的纯化与回收 | 第26-27页 |
| 3.2.4 DNA与载体的连接反应 | 第27页 |
| 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第27页 |
| 3.2.6 连接产物的转化 | 第27-28页 |
| 3.2.7 质粒的小量制备(碱裂解法) | 第28页 |
| 3.2.8 重组质粒的酶切鉴定 | 第28页 |
| 3.2.9 猪链球菌2型感受态细胞的制备 | 第28页 |
| 3.2.10 猪链球菌2型感受态细胞的电转化 | 第28-29页 |
| 3.2.11 突变株的筛选和鉴定 | 第29页 |
| 3.2.12 突变株ΔSloR的遗传稳定性分析 | 第29页 |
| 3.2.13 突变株ΔSloR与亲本菌株生长曲线比较 | 第29页 |
| 3.2.14 突变株ΔSloR与亲本菌株离子摄取能力的质谱分析 | 第29-30页 |
| 3.2.15 菌落形态和溶血活性的比较 | 第30页 |
| 3.2.16 RNA的提取 | 第30-31页 |
| 3.2.17 小鼠半数致死量试验 | 第31页 |
| 3.2.18 蛋白质的诱导表达 | 第31-32页 |
| 3.2.19 蛋白质的鉴定(SDS-PAGE) | 第32-33页 |
| 3.2.20 蛋白的亲和纯化 | 第33页 |
| 3.2.21 蛋白质浓度的测定 | 第33-34页 |
| 3.2.22 Western Blot | 第34-35页 |
| 3.2.23 电泳迁移率实验(EMSA) | 第35页 |
| 3.2.24 DAP-seq方法研究转录调控 | 第35-37页 |
| 4. 结果与分析 | 第37-51页 |
| 4.1 猪链球菌2型突变株ΔsloR的构建 | 第37-40页 |
| 4.1.1 sloR基因上下游同源臂和红霉素抗性基因的扩增 | 第37-38页 |
| 4.1.2 温敏型自杀性重组质粒pSET4s-sloR的构建 | 第38-39页 |
| 4.1.3 猪链球菌2型sloR基因缺失突变株ΔsloR的筛选 | 第39-40页 |
| 4.2 突变株ΔsloR生物学特性的研究 | 第40-44页 |
| 4.2.1 突变株遗传稳定性鉴定 | 第40页 |
| 4.2.2 生长曲线分析 | 第40-42页 |
| 4.2.3 离子摄取能力的质谱分析 | 第42-44页 |
| 4.2.4 小鼠半数致死量试验 | 第44页 |
| 4.3 SloR蛋白的表达与验证 | 第44-46页 |
| 4.3.1 重组表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| 4.3.2 SloR蛋白的表达、纯化和验证 | 第45-46页 |
| 4.4 电泳迁移率试验(EMSA) | 第46-47页 |
| 4.5 DAP-seq测序结果及分析 | 第47-51页 |
| 5. 讨论 | 第51-54页 |
| 5.1 突变株ΔsloR的构建与筛选 | 第51页 |
| 5.2 突变株互补菌株的构建问题 | 第51-52页 |
| 5.3 突变株ΔsloR生物学性状的研究 | 第52页 |
| 5.4 电泳迁移率试验(EMSA)与DAP-seq | 第52-54页 |
| 6. 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
