| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 1 前言 | 第11-18页 |
| 1.1 人肠道病毒71型概述 | 第11-14页 |
| 1.1.1 人肠道病毒分类 | 第11页 |
| 1.1.2 EV71感染后的临床症状 | 第11-12页 |
| 1.1.3 EV71复制周期 | 第12-13页 |
| 1.1.4 EV71 3A蛋白概述 | 第13-14页 |
| 1.2 噬菌体展示技术简介 | 第14-15页 |
| 1.3 pET原核表达系统 | 第15-16页 |
| 1.4 研究目的及意义 | 第16-18页 |
| 2 实验材料 | 第18-23页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第18页 |
| 2.2 实验仪器 | 第18-19页 |
| 2.3 实验试剂 | 第19页 |
| 2.4 常用培养基的配制 | 第19-20页 |
| 2.4.1 LB液体培养基(1L) | 第19页 |
| 2.4.2 LB固体培养基 | 第19页 |
| 2.4.3 顶层培养基 | 第19-20页 |
| 2.5 常用溶液的配制 | 第20-22页 |
| 2.5.1 LiCl法提取质粒缓冲液 | 第20页 |
| 2.5.2 琼脂糖凝胶电泳缓冲液 | 第20页 |
| 2.5.3 Tricine SDS-PAGE(Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳)所用溶液 | 第20-21页 |
| 2.5.4 Western Blot缓冲液 | 第21页 |
| 2.5.6 蛋白质纯化相关缓冲液 | 第21页 |
| 2.5.7 0.1M异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG) | 第21-22页 |
| 2.6 噬菌体筛选相关溶液 | 第22页 |
| 2.7 各种抗生素 | 第22-23页 |
| 2.7.1 卡那霉素(Kalamycin,Kana) | 第22页 |
| 2.7.2 羧苄青霉素(Carbenicillin,Carb) | 第22-23页 |
| 3 实验方法 | 第23-35页 |
| 3.1 肠病毒71型3A-60aa基因片段表达质粒的构建 | 第23-27页 |
| 3.1.1 设计引物 | 第23-24页 |
| 3.1.2 PCR产物回收及纯化 | 第24页 |
| 3.1.3 LiCl法提取质粒 | 第24-25页 |
| 3.1.4 双酶切pET28(+)与回收PCR产物 | 第25-26页 |
| 3.1.5 酶切产物回收 | 第26页 |
| 3.1.6 目的基因与载体连接 | 第26页 |
| 3.1.7 CaCl_2法制备DH5α感受态细胞 | 第26页 |
| 3.1.8 转化 | 第26-27页 |
| 3.1.9 质粒提取 | 第27页 |
| 3.1.10 重组质粒pET28a(+)-3a-60aa双酶切验证 | 第27页 |
| 3.1.11 保存菌种 | 第27页 |
| 3.2 His-3A-60aa融合蛋白表达 | 第27-30页 |
| 3.2.1 CaCl_2法制备BL21感受态细胞 | 第27-28页 |
| 3.2.2 pET28a(+)-3A-60aa转化感受态细胞BL21 | 第28页 |
| 3.2.3 3 A-60aa融合蛋白的诱导表达 | 第28-29页 |
| 3.2.4 Tricine-SDS-PAGE电泳 | 第29页 |
| 3.2.5 Western Blot检测 | 第29-30页 |
| 3.3 His-3A-60aa融合蛋白大量表达 | 第30页 |
| 3.4 His-3A-60aa融合蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 3.4.1 样品处理 | 第30页 |
| 3.4.2 Ni-NTA树脂处理 | 第30页 |
| 3.4.3 纯化3A-60aa融合蛋白 | 第30-31页 |
| 3.5 用脱盐柱脱盐 | 第31页 |
| 3.6 Bradford法测定3A-60aa蛋白浓度 | 第31-32页 |
| 3.7 利用噬菌体展示技术筛选3A相互作用蛋白 | 第32-35页 |
| 3.7.1 原始文库滴度测定 | 第32页 |
| 3.7.2 T7噬菌体文库扩增及保存 | 第32-33页 |
| 3.7.3 扩增后文库的滴度测定 | 第33页 |
| 3.7.4 包被纯化的3A-60aa蛋白 | 第33页 |
| 3.7.5 亲和筛选 | 第33页 |
| 3.7.6 PCR鉴定 | 第33-34页 |
| 3.7.7 PCR产物序列测序及同源性分析 | 第34-35页 |
| 4 实验结果 | 第35-45页 |
| 4.1 pET28a(+)-3A-60aa原核表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 4.1.1 PCR扩增3a-60aaDNA片段 | 第35页 |
| 4.1.2 pET28a(+)-3A-60aa重组质粒的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 4.1.3 重组质粒pET28a(+)-3a-60aa的序列测定 | 第36页 |
| 4.2 His-3A-60aa融合蛋白表达 | 第36-37页 |
| 4.3 His-3A-60aa蛋白纯化 | 第37-38页 |
| 4.4 His-3A-60aa纯化蛋白Western Blot鉴定 | 第38-39页 |
| 4.5 蛋白含量的测定 | 第39-40页 |
| 4.5.1 标准曲线的制作 | 第39-40页 |
| 4.5.2 His-3A-60aa蛋白含量的测定 | 第40页 |
| 4.6 T7噬菌体展示筛选His-3A-60aa相互作用蛋白 | 第40-43页 |
| 4.6.1 噬菌体富集结果 | 第40页 |
| 4.6.2 PCR鉴定 | 第40-41页 |
| 4.6.3 序列比对及同源性分析 | 第41-43页 |
| 4.7 讨论 | 第43-45页 |
| 参考文献 | 第45-49页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50页 |
