| 摘要 | 第3-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第一章 引言 | 第15-27页 |
| 1.1 对虾白斑综合症病毒(WSSV)研究概况 | 第15-19页 |
| 1.1.1 对虾白斑综合症病毒的发现 | 第15页 |
| 1.1.2 对虾白斑综合症病毒的形态学特征、组织病理学特点、宿主范围及传播途径 | 第15-16页 |
| 1.1.3 WSSV在宿主体内的感染增殖 | 第16页 |
| 1.1.4 对虾白斑综合症病毒的蛋白组学研究 | 第16-18页 |
| 1.1.5 关于囊膜蛋白VP28的研究 | 第18-19页 |
| 1.2 无脊椎动物免疫系统的研究 | 第19-22页 |
| 1.2.1 细胞免疫 | 第19-20页 |
| 1.2.2 体液免疫 | 第20-22页 |
| 1.2.2.1 抗菌肽 | 第20页 |
| 1.2.2.2 模式识别受体 | 第20-21页 |
| 1.2.2.3 唐氏综合症细胞粘附分子(Dscam) | 第21-22页 |
| 1.3 酵母双杂交系统的概述 | 第22-24页 |
| 1.4 RNA干扰的作用机理 | 第24-25页 |
| 1.4.1 RNA干扰的概念和起源 | 第24页 |
| 1.4.2 RNAi作用机制与应用 | 第24-25页 |
| 1.5 课题研究的目的和意义 | 第25-27页 |
| 第二章 酵母双杂交技术分析VP28蛋白与Dscam变构体库的相互作用 | 第27-47页 |
| 2.1 实验材料和仪器 | 第28-31页 |
| 2.1.1 实验相关基因的合成 | 第28-29页 |
| 2.1.2 主要试剂及试剂盒 | 第29-30页 |
| 2.1.3 主要实验仪器 | 第30页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-40页 |
| 2.2.1 目的基因的扩培与鉴定 | 第31-33页 |
| 2.2.1.1 目的基因的扩培与保存 | 第31-32页 |
| 2.2.1.2 目的基因的PCR鉴定 | 第32-33页 |
| 2.2.2 载体构建 | 第33-37页 |
| 2.2.2.1 质粒扩培 | 第33页 |
| 2.2.2.2 试剂盒提取载体质粒 | 第33-34页 |
| 2.2.2.3 目的基因PCR产物的纯化 | 第34页 |
| 2.2.2.4 纯化的PCR产物的双酶切 | 第34-35页 |
| 2.2.2.5 质粒的双酶切处理 | 第35-36页 |
| 2.2.2.6 目的基因片段与载体的连接 | 第36页 |
| 2.2.2.7 重组质粒的PCR以及测序鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.3 病毒蛋白诱饵的自激活和毒性测试 | 第37-38页 |
| 2.2.3.1 酵母感受态的制备 | 第37页 |
| 2.2.3.2 质粒转化 | 第37-38页 |
| 2.2.4 酵母双杂交文库的筛选 | 第38-40页 |
| 2.2.4.1 酵母菌的有性杂交 | 第38-39页 |
| 2.2.4.2 杂交后酵母菌的PCR验证及筛选 | 第39-40页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第40-45页 |
| 2.3.1 重组质粒的PCR与测序鉴定 | 第40-41页 |
| 2.3.2 VP28自激活作用和毒性检测 | 第41-43页 |
| 2.3.2.1 VP28的自激活作用 | 第41-43页 |
| 2.3.2.2 VP28的毒性 | 第43页 |
| 2.3.3 酵母菌Y2HGold与Y187杂交 | 第43-45页 |
| 2.3.3.1 融合过程观察 | 第43-44页 |
| 2.3.3.2 杂交后酵母菌的PCR验证 | 第44-45页 |
| 2.3.3.3 杂交酵母菌筛选 | 第45页 |
| 2.4 讨论 | 第45-46页 |
| 2.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 RNA干扰后LvDscam基因表达量的变化 | 第47-61页 |
| 3.1 实验材料与方法 | 第48-49页 |
| 3.1.1 siRNA序列的合成 | 第48页 |
| 3.1.2 实验对虾 | 第48页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第48页 |
| 3.1.4 实验仪器 | 第48-49页 |
| 3.1.5 主要试剂的配制 | 第49页 |
| 3.2 实验方法 | 第49-54页 |
| 3.2.1 RNA干扰实验 | 第49-50页 |
| 3.2.2 总RNA的提取 | 第50-51页 |
| 3.2.3 总RNA纯度和浓度的测定 | 第51页 |
| 3.2.4 消除污染的DNA | 第51页 |
| 3.2.5 cDNA合成 | 第51-52页 |
| 3.2.6 引物的合成 | 第52页 |
| 3.2.7 聚合酶链式反应(PCR) | 第52-53页 |
| 3.2.8 实时荧光定量PCR | 第53页 |
| 3.2.9 数据处理与统计 | 第53-54页 |
| 3.3 结果与分析 | 第54-59页 |
| 3.3.1 PCR验证cDNA合成效果 | 第54-55页 |
| 3.3.2 荧光定量PCR特异性及扩增效率检测结果 | 第55-57页 |
| 3.3.3 荧光定量PCR检测RNAi对LvDscam基因表达的抑制作用 | 第57-59页 |
| 3.3.3.1 实验1组RNAi对LvDscam基因表达的抑制作用 | 第57页 |
| 3.3.3.2 实验2组RNAi对LvDscam基因表达的抑制作用 | 第57-59页 |
| 3.3.3.3 缓冲液组LvDscam基因的转录水平 | 第59页 |
| 3.4 讨论 | 第59-60页 |
| 3.5 本章小结 | 第60-61页 |
| 第四章 Dscam蛋白在凡纳对虾血细胞对WSSV的吞噬过程中起调节作用 | 第61-71页 |
| 4.1 实验材料和仪器 | 第62-63页 |
| 4.1.1 实验病毒和对虾 | 第62页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第62页 |
| 4.1.3 实验仪器 | 第62页 |
| 4.1.4 实验主要试剂配制 | 第62-63页 |
| 4.2 实验方法 | 第63-66页 |
| 4.2.1 重组芽孢菌B.subtilis-VP28复苏及纯化 | 第63-64页 |
| 4.2.2 实验虾料制备 | 第64页 |
| 4.2.3 口服免疫及RNAi实验 | 第64页 |
| 4.2.4 对虾血细胞的分离 | 第64-65页 |
| 4.2.5 WSSV荧光标记 | 第65页 |
| 4.2.6 细胞吞噬实验 | 第65-66页 |
| 4.2.7 数据处理 | 第66页 |
| 4.3 结果分析 | 第66-68页 |
| 4.3.1 RNAi沉默Dscam基因对血细胞特异性吞噬WSSV的影响 | 第66-67页 |
| 4.3.2 RNAi沉默Dscam基因对血细胞特异性吞噬WSSV的影响 | 第67页 |
| 4.3.3 RNAi沉默Dscam基因后对虾血细胞特异性吞噬效果 | 第67-68页 |
| 4.4 讨论 | 第68-69页 |
| 4.5 本章小结 | 第69-71页 |
| 第五章 总结、创新和展望 | 第71-75页 |
| 5.1 总结 | 第71-72页 |
| 5.2 创新点 | 第72页 |
| 5.3 展望 | 第72-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 致谢 | 第83-85页 |
| 硕士期间发表文章 | 第85-87页 |
