| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 目录 | 第6-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-17页 |
| 1.1 氨肽酶概述 | 第9-11页 |
| 1.1.1 氨肽酶催化特性及分类 | 第9-10页 |
| 1.1.2 氨肽酶来源 | 第10页 |
| 1.1.3 氨肽酶应用 | 第10-11页 |
| 1.2 国内外研究现状 | 第11-13页 |
| 1.2.1 国外研究现状 | 第11-12页 |
| 1.2.2 国内研究现状 | 第12-13页 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 | 第13-14页 |
| 1.4 重组大肠杆菌的高密度培养 | 第14-15页 |
| 1.5 立题意义 | 第15-16页 |
| 1.6 本文研究内容 | 第16-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-25页 |
| 2.1 材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第17页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第17-18页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第18页 |
| 2.1.4 培养基与溶液 | 第18-19页 |
| 2.2 方法 | 第19-25页 |
| 2.2.1 脯氨酸氨肽酶编码基因的克隆 | 第19-20页 |
| 2.2.2 PCR 产物的纯化及回收 | 第20页 |
| 2.2.3 PCR 产物与 T 载连接及测序 | 第20页 |
| 2.2.4 感受态的制备及转化 | 第20-21页 |
| 2.2.5 脯氨酸氨肽酶基因的序列分析 | 第21页 |
| 2.2.6 脯氨酸氨肽酶二级结构分析及三维结构模拟 | 第21页 |
| 2.2.7 目的基因与 pET-28a(+)载体连接 | 第21页 |
| 2.2.8 阳性克隆的挑选及验证 | 第21-22页 |
| 2.2.9 工程菌生长曲线的测定 | 第22页 |
| 2.2.10 脯氨酸氨肽酶酶活力的测定 | 第22页 |
| 2.2.11 工程菌的诱导表达及表达验证 | 第22页 |
| 2.2.12 IPTG 诱导表达条件的初步探索 | 第22页 |
| 2.2.13 重组酶的纯化 | 第22-23页 |
| 2.2.14 重组酶酶学性质的探索 | 第23页 |
| 2.2.15 摇瓶发酵条件优化 | 第23页 |
| 2.2.16 重组菌在 7 L 发酵罐上高密度发酵的探究 | 第23-24页 |
| 2.2.17 重组酶水解胶原蛋白水解产物分析 | 第24页 |
| 2.2.18 Gly241Pro 突变体构建 | 第24-25页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第25-47页 |
| 3.1 脯氨酸氨肽酶基因（pap）的克隆 | 第25-26页 |
| 3.2 A. oryzae JN-412 脯氨酸氨肽酶与其他氨肽酶氨基酸序列比较 | 第26-27页 |
| 3.3 A. oryzae JN-412 脯氨酸氨肽酶二级结构分析及三维结构建模 | 第27-28页 |
| 3.4 产脯氨酸氨肽酶重组大肠杆菌菌株的构建 | 第28-29页 |
| 3.5 脯氨酸氨肽酶在大肠杆菌中的表达 | 第29-30页 |
| 3.6 脯氨酸氨肽酶在大肠杆菌中表达条件的优化 | 第30-32页 |
| 3.6.1 产脯氨酸氨肽酶重组大肠杆菌生长曲线 | 第30页 |
| 3.6.2 诱导后培养温度对重组脯氨酸氨肽酶表达的影响 | 第30-31页 |
| 3.6.3 IPTG 浓度对重组脯氨酸氨肽酶表达的影响 | 第31页 |
| 3.6.4 诱导时间对重组脯氨酸氨肽酶表达的影响 | 第31-32页 |
| 3.6.5 重组脯氨酸氨肽酶的纯化 | 第32页 |
| 3.7 重组酶酶学性质研究 | 第32-36页 |
| 3.7.1 pH 值对重组脯氨酸氨肽酶活性及稳定性的影响 | 第33页 |
| 3.7.2 温度对重组脯氨酸氨肽酶活性及稳定性的影响 | 第33页 |
| 3.7.3 金属离子及抑制剂对重组脯氨酸氨肽酶活性的影响 | 第33-34页 |
| 3.7.4 重组脯氨酸氨肽酶动力学分析 | 第34-35页 |
| 3.7.5 脯氨酸氨肽酶在水解胶原蛋白方面的应用探究 | 第35-36页 |
| 3.8 摇瓶发酵培养基及发酵条件优化 | 第36-43页 |
| 3.8.1 葡萄糖添加量的优化 | 第36-37页 |
| 3.8.2 氮源种类及添加量的优化 | 第37-38页 |
| 3.8.3 基础培养基中 Mg2+浓度的优化 | 第38页 |
| 3.8.4 诱导时机的优化 | 第38-39页 |
| 3.8.5 乳糖添加量的优化 | 第39页 |
| 3.8.6 诱导时间的优化 | 第39-40页 |
| 3.8.7 发酵培养基初始 pH 的优化 | 第40页 |
| 3.8.8 装液量的优化 | 第40-41页 |
| 3.8.9 接种量的优化 | 第41页 |
| 3.8.10 摇瓶发酵培养基的确定 | 第41-43页 |
| 3.9 发酵罐培养 | 第43-44页 |
| 3.9.1 分批发酵 | 第43-44页 |
| 3.9.2 补料分批发酵 | 第44页 |
| 3.10 Gly241Pro 突变对脯氨酸氨肽酶热稳定性的影响 | 第44-47页 |
| 3.10.1 分子动力学模拟确定突变位点 | 第44-45页 |
| 3.10.2 突变体分子动力学模拟 | 第45页 |
| 3.10.3 突变酶基因表达及蛋白纯化 | 第45-46页 |
| 3.10.4 野生酶及突变酶动力学参数测定 | 第46页 |
| 3.10.5 野生酶及突变酶热稳定性测定 | 第46-47页 |
| 主要结论与展望 | 第47-49页 |
| 主要结论 | 第47-48页 |
| 展望 | 第48-49页 |
| 致谢 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-54页 |
| 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第54页 |
| 申请专利 | 第54-55页 |
| 附件 | 第55-56页 |
