| 摘要 | 第9-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 第1章 绪论 | 第12-23页 |
| 1.1 海藻糖简介 | 第12-15页 |
| 1.1.1 海藻糖的来源及发现 | 第12页 |
| 1.1.2 海藻糖的应用 | 第12-14页 |
| 1.1.3 海藻糖的性质功能 | 第14-15页 |
| 1.2 酶法生产海藻糖的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.2.1 海藻糖-6 磷酸合成酶和海藻糖-6 磷酸磷酸酯酶 | 第15-16页 |
| 1.2.2 麦芽寡糖海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶 | 第16页 |
| 1.2.3 海藻糖合酶 | 第16页 |
| 1.3 毕赤酵母表面展示技术 | 第16-20页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统简介 | 第16-17页 |
| 1.3.2 毕赤酵母启动子简介 | 第17-18页 |
| 1.3.3 毕赤酵母表面展示技术 | 第18-19页 |
| 1.3.4 毕赤酵母表面展示应用 | 第19-20页 |
| 1.4 绿色增强型荧光蛋白的应用 | 第20-21页 |
| 1.4.1 绿色增强型荧光蛋白的来源 | 第20-21页 |
| 1.4.2 增强型绿色荧光蛋白的特点 | 第21页 |
| 1.4.3 EGFP在毕赤酵母表达系统中的作用 | 第21页 |
| 1.5 课题的立题背景和研究内容 | 第21-23页 |
| 1.5.1 立题背景 | 第21-22页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第22-23页 |
| 第2章 绿色荧光蛋白在毕赤酵母表面的表达 | 第23-41页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-26页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第23页 |
| 2.2.2 试剂与药品 | 第23-24页 |
| 2.2.3 仪器及设备 | 第24-25页 |
| 2.2.4 主要培养基和试剂配制 | 第25-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-33页 |
| 2.3.1 恶臭假单胞菌基因组DNA的提取 | 第26页 |
| 2.3.2 pPICZαA质粒的提取 | 第26页 |
| 2.3.3 质粒pEGFP-N1的提取 | 第26页 |
| 2.3.4 酿酒酵母基因组提取 | 第26-27页 |
| 2.3.5 PCR扩增tres基因、pir1p基因、egfp基因 | 第27-29页 |
| 2.3.6 egfp-pir1p融合基因片段制备 | 第29页 |
| 2.3.7 重组T载体的构建及菌落PCR验证 | 第29-30页 |
| 2.3.8 pPICZαA-tres的构建和pPICZαA-tres-egfp-pir1p的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.9 pPICZαA-tres-egfp-pir1p的线性化及浓缩 | 第31-32页 |
| 2.3.10 毕赤酵母感受态的制备与转化 | 第32页 |
| 2.3.11 重组毕赤酵母GS115/pPICZαA-tres-egfp-pir1p的筛选 | 第32页 |
| 2.3.12 阳性重组子外源蛋白的诱导与表达 | 第32-33页 |
| 2.3.13 流式细胞仪检测融合蛋白的荧光强度 | 第33页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第33-39页 |
| 2.4.1 恶臭假单胞菌基因组和酿酒酵母基因组的提取 | 第33页 |
| 2.4.2 质粒pPICZαA和pEGFP-N1的提取 | 第33-34页 |
| 2.4.3 目的基因的扩增 | 第34-35页 |
| 2.4.4 重组T载体的构建及菌落PCR验证 | 第35-36页 |
| 2.4.5 pPICZαA-tres的构建和pPICZαA-tres-egfp-pir1p的构建 | 第36-38页 |
| 2.4.6 重组毕赤酵母菌落PCR的鉴定 | 第38页 |
| 2.4.7 流式细胞仪检测融合蛋白的荧光强度 | 第38-39页 |
| 2.5 本章小结 | 第39-41页 |
| 第3章 海藻糖合酶在毕赤酵母表面的展示 | 第41-51页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料 | 第41-43页 |
| 3.2.1 实验菌株 | 第41页 |
| 3.2.2 药品与试剂 | 第41页 |
| 3.2.3 仪器与设备 | 第41页 |
| 3.2.4 主要培养基及试剂配制 | 第41-43页 |
| 3.3 实验方法 | 第43-45页 |
| 3.3.1 恶臭假单胞菌基因组DNA的提取 | 第43页 |
| 3.3.2 pPICZαA质粒的提取 | 第43页 |
| 3.3.3 酿酒酵母基因组提取 | 第43页 |
| 3.3.4 PCR扩增tres基因、pir1p基因 | 第43-44页 |
| 3.3.5 重组毕赤酵母GS115/pPICZαA-tres-pir1p的构建 | 第44页 |
| 3.3.6 表面展示海藻糖合酶的检测及酶活测定 | 第44-45页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第45-49页 |
| 3.4.1 目的基因tres和pir1p的扩增 | 第45页 |
| 3.4.2 质粒pPICZαA-tres-pir1p的构建 | 第45-47页 |
| 3.4.3 GS115/pPICZαA-tres-pir1p的筛选与鉴定 | 第47页 |
| 3.4.4 GS115/pPICZαA-tres-pir1p外源蛋白的检测及酶活测定 | 第47-49页 |
| 3.5 本章小结 | 第49-51页 |
| 第4章 表面展示海藻糖合酶发酵条件及酶学性质研究 | 第51-60页 |
| 4.1 引言 | 第51页 |
| 4.2 实验材料 | 第51-53页 |
| 4.2.1 实验菌株 | 第51页 |
| 4.2.2 药品与试剂 | 第51-52页 |
| 4.2.3 仪器及设备 | 第52-53页 |
| 4.3 实验方法 | 第53-54页 |
| 4.3.1 菌种的活化与外源蛋白的诱导表达 | 第53页 |
| 4.3.2 诱导温度对外源蛋白表达量的影响 | 第53页 |
| 4.3.3 诱导pH对外源蛋白表达量的影响 | 第53页 |
| 4.3.4 甲醇诱导浓度对外源蛋白表达量的影响 | 第53页 |
| 4.3.5 重组酵母细胞GS115/pPICZαA-tres-pir1p的小试试验 | 第53页 |
| 4.3.6 酶活单位的定义 | 第53-54页 |
| 4.3.7 表面展示海藻糖合酶最适反应温度及温度耐受性测定 | 第54页 |
| 4.3.8 表面展示海藻糖合酶最适反应pH及pH耐受性测定 | 第54页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第54-58页 |
| 4.4.1 诱导温度对外源蛋白表达量的影响 | 第54-55页 |
| 4.4.2 诱导pH对外源蛋白表达量的影响 | 第55页 |
| 4.4.3 甲醇诱导浓度对外源蛋白表达量的影响 | 第55-56页 |
| 4.4.4 表面展示海藻糖合酶最适反应温度及温度耐受性测定 | 第56-57页 |
| 4.4.5 重组海藻糖合酶的最适反应pH及pH耐受性 | 第57-58页 |
| 4.5 本章小结 | 第58-60页 |
| 第5章 总结与展望 | 第60-62页 |
| 5.1 总结 | 第60页 |
| 5.2 展望 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 致谢 | 第68-70页 |
| 在学期间主要科研成果 | 第70页 |
