| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 1 引言 | 第13-29页 |
| 1.1 苜蓿概况 | 第13页 |
| 1.2 苜蓿属牧草国内外育种研究进展 | 第13-15页 |
| 1.3 苜蓿属牧草基因工程研究进展 | 第15-25页 |
| 1.3.1 紫花苜蓿基因工程研究进展 | 第15-23页 |
| 1.3.2 黄花苜蓿基因工程研究进展 | 第23-24页 |
| 1.3.3 转基因苜蓿安全性问题 | 第24页 |
| 1.3.4 转基因苜蓿发展趋势和应用前景 | 第24-25页 |
| 1.4 CBF基因研究进展 | 第25-29页 |
| 1.4.1 CBF基因简介 | 第25-26页 |
| 1.4.2 CBF基因结构关系 | 第26页 |
| 1.4.3 CBF基因的表达 | 第26页 |
| 1.4.4 CBF基因作用机理 | 第26页 |
| 1.4.5 国内CBF基因的研究与应用 | 第26-28页 |
| 1.4.6 国外CBF转录因子的研究与应用 | 第28页 |
| 1.4.7 CBF转录因子的应用前景 | 第28-29页 |
| 2 紫花苜蓿转CBF1基因研究目的及技术流程 | 第29-31页 |
| 2.1 研究目的及意义 | 第29页 |
| 2.2 研究内容及技术流程 | 第29-31页 |
| 3 紫花苜蓿高频组培再生体系建立 | 第31-41页 |
| 3.1 材料 | 第31-32页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第31页 |
| 3.1.2 培养基 | 第31-32页 |
| 3.2 方法 | 第32-33页 |
| 3.2.1 无菌苗培养 | 第32-33页 |
| 3.2.2 外植体制备 | 第33页 |
| 3.2.3 愈伤组织诱导 | 第33页 |
| 3.2.4 愈伤组织继代 | 第33页 |
| 3.2.5 愈伤组织分化 | 第33页 |
| 3.2.6 生根培养 | 第33页 |
| 3.2.7 评价指标 | 第33页 |
| 3.3 结果与分析 | 第33-38页 |
| 3.3.1 愈伤组织诱导培养基选择 | 第33-34页 |
| 3.3.2 继代培养基选择 | 第34-35页 |
| 3.3.3 分化培养基选择 | 第35-36页 |
| 3.3.4 外植体的选择 | 第36-37页 |
| 3.3.5 基因型的选择 | 第37页 |
| 3.3.6 苜蓿转化植株的生根培养 | 第37-38页 |
| 3.4 小结 | 第38页 |
| 3.5 讨论 | 第38-41页 |
| 3.5.1 基因型对愈伤组织分化的影响 | 第38-39页 |
| 3.5.2 外植体对愈伤组织分化的影响 | 第39页 |
| 3.5.3 AgNO_3对胚性愈伤率的影响 | 第39页 |
| 3.5.4 TDZ对胚性愈伤率的影响 | 第39-40页 |
| 3.5.5 KT对愈伤组织分化的影响 | 第40-41页 |
| 4 拟南芥冷诱导转录因子AtCBF1基因克隆与植物表达载体构建 | 第41-49页 |
| 4.1 材料 | 第41页 |
| 4.1.1 供试材料 | 第41页 |
| 4.1.2 菌株及载体 | 第41页 |
| 4.1.3 供试试剂 | 第41页 |
| 4.2 方法 | 第41-43页 |
| 4.2.1 拟南芥基因组DNA的提取 | 第41-42页 |
| 4.2.2 引物设计 | 第42页 |
| 4.2.3 PCR体系 | 第42页 |
| 4.2.4 PCR产物与T载体的连接 | 第42页 |
| 4.2.5 重组子的验证 | 第42页 |
| 4.2.6 植物表达载体pBI121-CBF1的构建 | 第42-43页 |
| 4.3 结果与分析 | 第43-47页 |
| 4.3.1 引物筛选 | 第43页 |
| 4.3.2 CBF1基因的克隆及鉴定 | 第43-44页 |
| 4.3.3 AtCBF1基因序列分析 | 第44-45页 |
| 4.3.4 植物表达载体PBI121-CBF1的构建 | 第45-47页 |
| 4.4 小结 | 第47页 |
| 4.5 讨论 | 第47-49页 |
| 4.5.1 AtCBF1基因的克隆 | 第47-48页 |
| 4.5.2 植物表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 5 紫花苜蓿农杆菌遗传转化体系及转化植株的分子生物学检测 | 第49-63页 |
| 5.1 材料 | 第49页 |
| 5.1.1 植物材料 | 第49页 |
| 5.1.2 菌株和质粒 | 第49页 |
| 5.1.3 培养基? | 第49页 |
| 5.2 方法 | 第49-53页 |
| 5.2.1 抗菌素类型选择及浓度确定 | 第49页 |
| 5.2.2 确定Kan筛选压实验 | 第49-50页 |
| 5.2.3 不同基因型紫花苜蓿对转化的影响 | 第50页 |
| 5.2.4 紫花苜蓿外植体类型对转化的影响 | 第50页 |
| 5.2.5 农杆菌菌液浓度与转化效率关系 | 第50页 |
| 5.2.6 侵染时间和转化效率的关系 | 第50页 |
| 5.2.7 AS浓度与转化效率的关系 | 第50页 |
| 5.2.8 紫花苜蓿遗传转化再生植株的获得 | 第50页 |
| 5.2.9 植物基因组RNA提取 | 第50-51页 |
| 5.2.10 再生植株PCR检测 | 第51-52页 |
| 5.2.11 转化植株CBF1基因转录检测 | 第52-53页 |
| 5.3 结果与分析 | 第53-60页 |
| 5.3.1 选择抗菌素种类及确定最佳浓度 | 第53-54页 |
| 5.3.2 选择培养中选择压的确定 | 第54-55页 |
| 5.3.3 不同基因型紫花苜蓿对转化率的影响 | 第55页 |
| 5.3.4 紫花苜蓿不同外植体对遗传转化影响 | 第55-56页 |
| 5.3.5 农杆菌菌液浓度对紫花苜蓿外植体转化率的影响 | 第56页 |
| 5.3.6 农杆菌侵染时间对转化率的影响 | 第56-57页 |
| 5.3.7 共培养基AS浓度对转化率的影响 | 第57-58页 |
| 5.3.8 紫花苜蓿抗性转化植株的获得 | 第58页 |
| 5.3.9 转化植株的PCR鉴定 | 第58-59页 |
| 5.3.10 转化植株的RT-PCR鉴定 | 第59-60页 |
| 5.4 小结 | 第60页 |
| 5.5 讨论 | 第60-63页 |
| 5.5.1 农杆菌菌株对转化的影响 | 第60-61页 |
| 5.5.2 Kan对转化效率的影响 | 第61页 |
| 5.5.3 侵染时间对转化效率的影响 | 第61页 |
| 5.5.4 AS对转化效率的影响 | 第61页 |
| 5.5.5 转化植株的鉴定 | 第61-63页 |
| 6 转基因紫花苜蓿抗寒性鉴定 | 第63-74页 |
| 6.1 材料 | 第63页 |
| 6.1.1 植物材料 | 第63页 |
| 6.1.2 叶片处理 | 第63页 |
| 6.1.3 整株处理 | 第63页 |
| 6.2 方法 | 第63-66页 |
| 6.2.1 游离脯氨酸测定 | 第63-64页 |
| 6.2.2 丙二醛含量测定 | 第64-65页 |
| 6.2.3 可溶性糖含量测定 | 第65-66页 |
| 6.2.4 相对电导率测定 | 第66页 |
| 6.2.5 人工模拟寒冻天气整株寒冻法测定 | 第66页 |
| 6.3 结果与分析 | 第66-71页 |
| 6.3.1 低温胁迫下转基因紫花苜蓿相对电导率分析 | 第66-67页 |
| 6.3.2 低温胁迫下转基因紫花苜蓿脯氨酸含量分析 | 第67-68页 |
| 6.3.3 低温胁迫下转基因紫花苜蓿可溶性糖含量分析 | 第68-69页 |
| 6.3.4 低温胁迫下转基因紫花苜蓿丙二醛含量分析 | 第69页 |
| 6.3.5 低温胁迫下人工模拟寒冻天气分析 | 第69-71页 |
| 6.4 小结 | 第71页 |
| 6.5 讨论 | 第71-74页 |
| 6.5.1 转入抗寒基因后紫花苜蓿植株耐寒生理检测指标筛选 | 第71-72页 |
| 6.5.2 转入抗寒基因后紫花苜蓿植株抗寒性直接鉴定法选择 | 第72-74页 |
| 7 转基因紫花苜蓿田间主要农艺性状观测 | 第74-84页 |
| 7.1 材料 | 第74页 |
| 7.1.1 植物材料 | 第74页 |
| 7.1.2 试验地概况 | 第74页 |
| 7.2 方法 | 第74-75页 |
| 7.2.1 成活率调查 | 第74页 |
| 7.2.2 植物学特征 | 第74页 |
| 7.2.3 产量 | 第74-75页 |
| 7.2.4 再生速度 | 第75页 |
| 7.2.5 品质 | 第75页 |
| 7.3 结果与分析 | 第75-82页 |
| 7.3.1 转基因植株移栽成活率 | 第75-77页 |
| 7.3.2 转基因紫花苜蓿主要农艺性状观测 | 第77-82页 |
| 7.4 小结 | 第82页 |
| 7.5 讨论 | 第82-84页 |
| 7.5.1 转入AtCBF1基因后紫花苜蓿植株形态性状的改变 | 第82-83页 |
| 7.5.2 转入AtCBF1基因后紫花苜蓿植株产量性状的改变 | 第83页 |
| 7.5.3 转入AtCBF1基因后紫花苜蓿植株营养性状的改变 | 第83-84页 |
| 8 结论 | 第84-85页 |
| 9 展望 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-100页 |
| 作者简介 | 第100页 |
