| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第7-13页 |
| 1.1 纳豆简介 | 第7页 |
| 1.2 纳豆激酶概述 | 第7-10页 |
| 1.2.1 纳豆激酶结构及生化性质 | 第7-8页 |
| 1.2.2 溶栓机理 | 第8-9页 |
| 1.2.3 纳豆激酶活性测定方法 | 第9页 |
| 1.2.4 纳豆激酶基因工程研究进展 | 第9-10页 |
| 1.3 B. subtilis调控元件及表达系统 | 第10-12页 |
| 1.3.1 Bacillus和B. subtilis | 第10页 |
| 1.3.2 B. subtilis表达系统 | 第10-11页 |
| 1.3.3 B. subtilis表达元件 | 第11-12页 |
| 1.4 本课题立题依据及意义 | 第12页 |
| 1.5 本课题主要研究内容 | 第12-13页 |
| 第二章 材料与方法 | 第13-24页 |
| 2.1 实验材料 | 第13-17页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第13-14页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第14-15页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第15页 |
| 2.1.4 培养基 | 第15-16页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第16-17页 |
| 2.2 重组纳豆激酶的克隆表达与纯化 | 第17-21页 |
| 2.2.1 质粒及基因组DNA的提取 | 第17页 |
| 2.2.2 目的片段及载体的纯化 | 第17页 |
| 2.2.3 E. coli JM109感受态细胞的制备及转化 | 第17页 |
| 2.2.4 重组质粒的构建 | 第17-20页 |
| 2.2.5 B. subtilis感受态细胞的制备与转化方法 | 第20-21页 |
| 2.2.6 重组纳豆激酶的表达及活性分析 | 第21页 |
| 2.3 重组菌液态发酵优化 | 第21-22页 |
| 2.3.1 重组菌摇瓶发酵培养方法 | 第21页 |
| 2.3.2 培养基组分的优化 | 第21页 |
| 2.3.3 重组菌 5 L罐发酵培养方法 | 第21-22页 |
| 2.4 重组菌的固态发酵 | 第22页 |
| 2.4.1 菌株及纳豆菌粉 | 第22页 |
| 2.4.2 纳豆制备工艺 | 第22页 |
| 2.4.3 种子液的制备 | 第22页 |
| 2.4.4 粗酶液的制备及活性测定 | 第22页 |
| 2.5 分析方法 | 第22-24页 |
| 2.5.1 菌液浓度(OD600)的测定 | 第22页 |
| 2.5.2 菌体细胞干重(DCW)的测定 | 第22-23页 |
| 2.5.3 蛋白浓度的测定 | 第23页 |
| 2.5.4 SDS-PAGE电泳分析 | 第23页 |
| 2.5.5 纳豆激酶活性的测定 | 第23-24页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第24-42页 |
| 3.1 启动子的筛选 | 第24-27页 |
| 3.1.1 含不同强启动子表达载体的构建 | 第24-25页 |
| 3.1.2 不同启动子对纳豆激酶重组菌株表达水平的影响 | 第25-27页 |
| 3.2 启动子的串联改造 | 第27-36页 |
| 3.2.1 表达载体的构建 | 第27-29页 |
| 3.2.2 两个启动子串联对纳豆激酶重组菌株表达水平的影响 | 第29-30页 |
| 3.2.3 多个启动子串联对纳豆激酶重组菌株表达水平的影响 | 第30-33页 |
| 3.2.4 核心区双拷贝型启动子对纳豆激酶重组菌表达水平的影响 | 第33-34页 |
| 3.2.5 核心区多拷贝型启动子对纳豆激酶重组菌表达水平的影响 | 第34-36页 |
| 3.3 重组菌B. subtilis WB800/pSG121液态发酵优化 | 第36-39页 |
| 3.3.1 重组菌接种菌龄的确定 | 第36-37页 |
| 3.3.2 氮源对菌体生长和产酶的影响 | 第37-38页 |
| 3.3.3 碳源对菌体生长和产酶的影响 | 第38页 |
| 3.3.4 碳氮比对菌体生长和产酶的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.5 重组菌的 5 L发酵罐实验 | 第39页 |
| 3.4 重组菌B. subtilis WB800/pSG121的固态发酵 | 第39-42页 |
| 3.4.1 冷冻干燥对重组菌产酶的影响 | 第40页 |
| 3.4.2 菌粉添加量对重组菌发酵的影响 | 第40-41页 |
| 3.4.3 对比实验 | 第41-42页 |
| 主要结论与展望 | 第42-44页 |
| 主要结论 | 第42页 |
| 展望 | 第42-44页 |
| 致谢 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-49页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第49页 |
