| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第10-23页 |
| 1.1 顶头孢霉菌和头孢菌素C | 第10-13页 |
| 1.1.1 顶头菌素应用发展 | 第10-11页 |
| 1.1.2 顶头菌素C合成路线 | 第11-13页 |
| 1.2 丝状真菌遗传转化研究进展 | 第13-15页 |
| 1.2.1 PEG介导的转化方法的研究进展 | 第13页 |
| 1.2.2 由农杆菌所介导的转化技术研究进展(ATMT) | 第13-15页 |
| 1.2.3 其他的转化方法 | 第15页 |
| 1.3 Ku同源基因的研究进展 | 第15-21页 |
| 1.3.1 Ku同源基因的作用机理 | 第16-18页 |
| 1.3.2 在丝状真菌中敲除Ku同源基因的研究进展 | 第18页 |
| 1.3.3 顶头孢霉菌Ku同源基因敲除的意义和可行性 | 第18-19页 |
| 1.3.4 构建顶头孢霉菌Ku同源基因敲除菌株的技术路线 | 第19-21页 |
| 1.3.4.1 敲除载体的构建 | 第20-21页 |
| 1.3.4.2 敲除载体的真菌转化 | 第21页 |
| 1.4 顶头孢霉菌Ku同源基因敲除的意义和可行性 | 第21-23页 |
| 第2章 材料和方法 | 第23-34页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-26页 |
| 2.1.1 菌种、质粒与引物 | 第23页 |
| 2.1.1.1 菌种 | 第23页 |
| 2.1.1.2 质粒 | 第23页 |
| 2.1.1.3 引物 | 第23页 |
| 2.1.2 实验制剂、试剂盒与酶 | 第23-24页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.4 溶液配制 | 第25-26页 |
| 2.1.5 培养基 | 第26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-34页 |
| 2.2.1 菌丝体的获得方法 | 第26页 |
| 2.2.2 原生质体的获得方法 | 第26-27页 |
| 2.2.3 血球计数板计数方法 | 第27页 |
| 2.2.4 原生质体再生方法 | 第27页 |
| 2.2.5 原生质体再生率考察方法 | 第27页 |
| 2.2.6 菌丝形态定量分析方法 | 第27-28页 |
| 2.2.7 E.coli DH5α-感受态细胞的制备 | 第28页 |
| 2.2.8 质粒pYG233转化E.coli DH5α感受态 | 第28页 |
| 2.2.9 顶头孢霉工业生产菌1-D1在博莱霉素上的抗性测试 | 第28-29页 |
| 2.2.10 PEG-CaCl_2介导的顶头孢霉菌原生质体转化 | 第29页 |
| 2.2.11 顶头孢霉菌转化株基因组提取 | 第29页 |
| 2.2.12 顶头孢霉菌转化株的PCR鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2.13 顶头孢霉菌Ku基因5'端和3'端序列的获得 | 第30-31页 |
| 2.2.14 启动子和抗性基因序列的获得 | 第31-32页 |
| 2.2.15 T-载体连接反应 | 第32页 |
| 2.2.16 连接产物转化以及蓝白斑筛选的方法 | 第32页 |
| 2.2.17 Ku基因5'端序列和ppt的拼接 | 第32-33页 |
| 2.2.18 双酶切连接法拼接Ku的3'端基因 | 第33-34页 |
| 第3章 顶头孢霉菌原生质体的制备和再生 | 第34-44页 |
| 3.1 引言 | 第34页 |
| 3.2 实验结果与分析 | 第34-42页 |
| 3.2.1 酶种类和复配比对顶头孢霉菌原生质体释放量的影响 | 第34-35页 |
| 3.2.2 酶解时间对原生质体释放和再生率的影响 | 第35-37页 |
| 3.2.3 菌丝形态分型以及不同菌型对原生质体制备和再生的影响 | 第37-41页 |
| 3.2.3.1 顶头孢霉菌丝形态分析 | 第37-39页 |
| 3.2.3.2 不同菌丝形态对原生质体的影响 | 第39-41页 |
| 3.2.4 涂布和再生培养基的影响 | 第41-42页 |
| 3.3 结果讨论 | 第42-43页 |
| 3.4 本章总结 | 第43-44页 |
| 第4章 顶头孢霉菌原生质体转化 | 第44-48页 |
| 4.1 引言 | 第44页 |
| 4.2 实验结果与分析 | 第44-47页 |
| 4.2.1 关于顶头孢霉菌工业生产种1-D1在博莱霉素上的抗性检测 | 第44页 |
| 4.2.2 关于顶头孢霉菌原生质体的转化 | 第44-45页 |
| 4.2.3 关于转化的顶头孢霉菌基因组提取 | 第45-46页 |
| 4.2.4 顶头孢霉菌转化株的PCR鉴定 | 第46-47页 |
| 4.3 讨论 | 第47页 |
| 4.4 本章总结 | 第47-48页 |
| 第5章 Ku基因敲除质粒的构建 | 第48-58页 |
| 5.1 前言 | 第48页 |
| 5.2 实验结果与分析 | 第48-56页 |
| 5.2.1 Ku基因上、下游同源臂基因的获得 | 第48-49页 |
| 5.2.2 Ku基因上、下游同源臂基因的测序 | 第49-51页 |
| 5.2.3 抗性基因的获得 | 第51-53页 |
| 5.2.4 抗性基因的测序 | 第53-54页 |
| 5.2.5 目的序列依次拼接 | 第54-56页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第56-57页 |
| 5.4 本章总结 | 第57-58页 |
| 第6章 结论与展望 | 第58-60页 |
| 6.1 结论 | 第58-59页 |
| 6.2 展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
