| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-21页 |
| 1.1 头孢类抗生素的概述 | 第12-15页 |
| 1.1.1 头孢类抗生素的简介 | 第12页 |
| 1.1.2 头孢类抗生素的产品发展 | 第12-14页 |
| 1.1.3 头孢类抗生素的市场及发展状况 | 第14-15页 |
| 1.1.4 头孢类抗生素的母核 | 第15页 |
| 1.2 7-氨基头孢氨酸的概述 | 第15-17页 |
| 1.3 头孢菌素C乙酰化酶的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.3.1 头孢菌素C乙酰化酶国外的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.3.2 国内关于头孢菌素C乙酰化酶的研究进展 | 第18-19页 |
| 1.4 本课题的研究目的和内容 | 第19-21页 |
| 2 实验材料和方法 | 第21-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-22页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂和试剂盒 | 第21-22页 |
| 2.1.3 典型耗材 | 第22页 |
| 2.2 主要仪器 | 第22页 |
| 2.3 常用储液及缓冲液的配制 | 第22-25页 |
| 2.3.1 50×TAE电泳缓冲液 | 第22-23页 |
| 2.3.2 裂解缓冲液 | 第23页 |
| 2.3.3 结合缓冲液(A液) | 第23页 |
| 2.3.4 洗脱缓冲液母液(B液) | 第23页 |
| 2.3.5 洗涤缓冲液和洗脱缓冲液 | 第23页 |
| 2.3.6 蛋白浓度测定的相关溶液 | 第23-24页 |
| 2.3.7 SDS-PAGE的相关溶液 | 第24页 |
| 2.3.8 头抱菌素C乙酰化酶活性测定的相关溶液 | 第24-25页 |
| 2.3.9 主要抗生素及诱导剂母液的配制 | 第25页 |
| 2.3.10 培养基的配制 | 第25页 |
| 2.4 分子生物学基本操作 | 第25-29页 |
| 2.4.1 质粒的提取 | 第25-26页 |
| 2.4.2 核酸电泳 | 第26页 |
| 2.4.3 琼脂糖凝胶回收 | 第26页 |
| 2.4.4 PCR或酶切产物的纯化 | 第26-27页 |
| 2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 2.4.6 热激转化 | 第27-28页 |
| 2.4.7 密码子的优化 | 第28页 |
| 2.4.8 多点定点突变 | 第28-29页 |
| 2.5 头孢菌素C乙酰化酶可溶性表达的探索 | 第29-33页 |
| 2.5.1 目的基因的获取 | 第29-30页 |
| 2.5.2 重组表达质粒的构建 | 第30-31页 |
| 2.5.3 重组大肠杆菌的常规表达 | 第31页 |
| 2.5.4 温度和诱导剂浓度对表达形态的影响 | 第31页 |
| 2.5.5 目的蛋白的分离纯化 | 第31-32页 |
| 2.5.6 头孢菌素C乙酰化酶的活性测定 | 第32-33页 |
| 2.5.7 头孢菌素C乙酰化酶蛋白浓度的测定 | 第33页 |
| 2.5.8 头孢菌素C乙酰化酶的SDS-PAGE分析 | 第33页 |
| 2.6 头孢菌素C乙酰化酶的理性改造 | 第33-34页 |
| 2.6.1 突变位点的理性选择 | 第33页 |
| 2.6.2 引物的设计、合成及多点突变 | 第33-34页 |
| 2.6.3 突变酶的可溶性表达 | 第34页 |
| 2.6.4 突变酶的酶活性及蛋白分析 | 第34页 |
| 2.7 低温头孢菌素C乙酰化酶定向进化及高通量筛选方法的研究 | 第34-37页 |
| 2.7.1 头孢菌素C乙酰化酶基因突变文库的构建 | 第34-35页 |
| 2.7.2 7-头孢氨基烷酸含量与A_(105)的相关性分析 | 第35页 |
| 2.7.3 不同头孢菌素C乙酰化酶加酶量对A_(105)的影响 | 第35-36页 |
| 2.7.4 头孢菌素C乙酰化酶的高通量表达 | 第36页 |
| 2.7.5 低温头孢菌素C乙酰化酶突变体的高通量筛选 | 第36页 |
| 2.7.6 阳性突变体的复筛 | 第36-37页 |
| 2.8 7-氨基头孢烷酸的生物合成 | 第37-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-51页 |
| 3.1 头孢菌素C乙酰化酶的密码子优化及基因合成 | 第38页 |
| 3.2 重组表达质粒的构建 | 第38-39页 |
| 3.3 头抱菌素C乙酰化酶的常规表达 | 第39-40页 |
| 3.4 头孢菌素C乙酰化酶的低温诱导 | 第40-42页 |
| 3.5 Trx标签对头孢菌素C乙酰化酶表达的影响 | 第42-43页 |
| 3.6 头孢菌素C乙酰化酶的理性改造 | 第43-46页 |
| 3.6.1 理性突变位点的选择及突变 | 第43-44页 |
| 3.6.2 重组酶的表达及纯化 | 第44-46页 |
| 3.7 头孢菌素C乙酰化酶的定向进化 | 第46-49页 |
| 3.7.1 7-氨基头孢烷酸含量与A_(105)的相关性 | 第46-47页 |
| 3.7.2 不同头孢菌素C乙酰化酶加酶量对A_(105)值变化的影响 | 第47-48页 |
| 3.7.3 低温头孢菌素C乙酰化酶高通量筛选及复筛 | 第48-49页 |
| 3.8 7-氨基头孢烷酸生物合成的初步研究 | 第49-51页 |
| 4 讨论 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 附录 | 第56-57页 |
| 附录A：攻读学位期间获得研究成果 | 第56-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
