| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-9页 |
| 第1章 前言 | 第9-13页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第9页 |
| ·人凝血因子Ⅶ的研究进展 | 第9-10页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统的研究进展 | 第10-11页 |
| ·RED同源重组系统在构建表达载体中的应用 | 第11-13页 |
| 第2章 连续三次基因抓捕构建人EEF1A1-人凝血因子Ⅶ杂合基因座 | 第13-29页 |
| ·材料 | 第13-15页 |
| ·载体与质粒 | 第13页 |
| ·工具酶与试剂盒 | 第13页 |
| ·引物 | 第13-14页 |
| ·主要溶液 | 第14页 |
| ·培养基 | 第14页 |
| ·核酸电泳用试剂 | 第14页 |
| ·碱裂解法提取质粒所用试剂 | 第14-15页 |
| ·主要仪器 | 第15页 |
| ·实验方法 | 第15-21页 |
| ·接菌 | 第15-16页 |
| ·转化 | 第16页 |
| ·质粒提取(东盛试剂盒碱裂解法提取小量细菌质粒DNA) | 第16-17页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第17页 |
| ·凝胶回收（QIAGEN试剂盒） | 第17-18页 |
| ·DNA的限制性酶切 | 第18页 |
| ·DNA片段纯化(TAKARA试剂盒) | 第18-19页 |
| ·外源DNA与质粒载体的连接反应 | 第19页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第19页 |
| ·化学感受态细胞的制备(氯化钙法)以及质粒热击转化方法 | 第19-20页 |
| ·电击感受态细胞的制备以及质粒电击转化的方法 | 第20-21页 |
| ·pBR322-gaprepair载体的构建 | 第21-22页 |
| ·三步连续基因抓捕过程 | 第22页 |
| ·结果 | 第22-25页 |
| ·pBR322-Gaprepair载体的构建 | 第22-23页 |
| ·三次连续基因抓捕 | 第23-25页 |
| ·测序 | 第25页 |
| ·讨论 | 第25-29页 |
| 第3章 hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座在293FT细胞中表达的研究 | 第29-43页 |
| ·材料 | 第29-31页 |
| ·细胞 | 第29页 |
| ·主要试剂和溶液 | 第29-30页 |
| ·主要耗材 | 第30页 |
| ·仪器 | 第30页 |
| ·鉴定引物 | 第30-31页 |
| ·方法 | 第31-37页 |
| ·细胞复苏 | 第31页 |
| ·细胞传代 | 第31-32页 |
| ·细胞冻存 | 第32页 |
| ·细胞培养 | 第32页 |
| ·转染所需DNA质粒的提取(Promega质粒提取试剂盒) | 第32-33页 |
| ·细胞转染(核电击转染法) | 第33页 |
| ·筛选单克隆 | 第33-34页 |
| ·细胞总RNA的提取(6孔板) | 第34页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第34-35页 |
| ·ELISA测定hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座表达量 | 第35-37页 |
| ·G418抗性对293FT细胞最小致死浓度确定 | 第37页 |
| ·结果 | 第37-40页 |
| ·hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座在293FT细胞中表达的鉴定 | 第37-39页 |
| ·hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座的ELISA检测结果 | 第39-40页 |
| ·讨论 | 第40-43页 |
| 结论 | 第43-45页 |
| 参考文献 | 第45-49页 |
| 附录 | 第49-51页 |
| 致谢 | 第51-53页 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 | 第53页 |
