| 中文目录 | 第1-8页 |
| 英文目录 | 第8-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 英文摘要 | 第13-15页 |
| 缩略词 | 第15-17页 |
| 前言 | 第17页 |
| 1.人免疫缺陷病毒及其治疗的研究进展 | 第17-25页 |
| ·艾滋病的流行概况 | 第17-18页 |
| ·人免疫缺陷病毒的分子生物学特征 | 第18-21页 |
| ·HIV的基因组结构 | 第18-19页 |
| ·HIV的病毒结构特征 | 第19-20页 |
| ·HIV的生活周期 | 第20-21页 |
| ·HIV的致病机制 | 第21页 |
| ·人免疫缺陷病毒的体外培养及动物模型 | 第21-23页 |
| ·人免疫缺陷病毒的体外培养 | 第21-22页 |
| ·人免疫缺陷病毒的动物模型 | 第22-23页 |
| ·人免疫缺陷病毒治疗的研究进展 | 第23-25页 |
| ·HIV治疗药物的研究进展 | 第23-24页 |
| ·HIV病毒疫苗的研究进展 | 第24-25页 |
| 2.人免疫缺陷病毒的基因治疗 | 第25-29页 |
| ·HIV基因治疗策略 | 第26-27页 |
| ·基因治疗靶细胞 | 第27-29页 |
| ·T淋巴细胞 | 第27-28页 |
| ·造血干细胞 | 第28-29页 |
| 3.RNA干扰的发现及其抗病毒应用 | 第29-34页 |
| ·RNA干扰的发现及其作用机理 | 第29-30页 |
| ·RNA干扰的特点 | 第30-31页 |
| ·RNA干扰应用研究进展 | 第31-32页 |
| ·siRNA基因治疗所面临的挑战 | 第32-34页 |
| ·siRNA脱靶效应 | 第32-33页 |
| ·RNA干扰元件的细胞导入难题 | 第33-34页 |
| ·病毒的逃逸突变 | 第34页 |
| 4.慢病毒载体介导的RNA干扰在HIV-1治疗中的应用 | 第34-45页 |
| ·慢病毒载体系统 | 第34-38页 |
| ·包装系统的改造 | 第35-36页 |
| ·慢病毒包膜蛋白的改进 | 第36-37页 |
| ·基因转移载体的改造 | 第37-38页 |
| ·慢病毒载体介导的RNA干扰 | 第38-40页 |
| ·慢病毒载体介导的RNAi应用于HIV-1治疗——进展与挑战 | 第40-43页 |
| ·miRNA基因簇的应用 | 第43-44页 |
| ·本研究的思路、目的与意义 | 第44-45页 |
| 材料与方法 | 第45-60页 |
| 1.材料 | 第45-49页 |
| ·主要仪器 | 第45-46页 |
| ·菌株、质粒、细胞株、病毒株 | 第46-47页 |
| ·E.coli菌株 | 第46页 |
| ·质粒 | 第46页 |
| ·细胞株 | 第46页 |
| ·实验动物 | 第46-47页 |
| ·试剂 | 第47页 |
| ·常用溶液及培养基配制 | 第47-49页 |
| ·大肠杆菌培养基的配制 | 第47页 |
| ·抗生素储备液的配制 | 第47-48页 |
| ·分子生物学实验用液的配制 | 第48页 |
| ·细胞生物学实验用液的配制 | 第48-49页 |
| 2.方法 | 第49-60页 |
| ·分子生物学实验方法 | 第49-51页 |
| ·碱裂解法小量提取质粒 | 第49页 |
| ·质粒小量提取试剂盒操作 | 第49页 |
| ·酶切 | 第49-50页 |
| ·制备型酶切 | 第49-50页 |
| ·小量酶切鉴定 | 第50页 |
| ·目的片段回收 | 第50页 |
| ·小量胶回收DNA片段 | 第50页 |
| ·乙醇沉淀法回收线性化质粒 | 第50页 |
| ·引物退火 | 第50页 |
| ·连接 | 第50页 |
| ·E.coli感受态细胞的大量制备 | 第50-51页 |
| ·连接物转化 | 第51页 |
| ·质粒转化 | 第51页 |
| ·DNA浓度的测定 | 第51页 |
| ·细胞生物学实验方法 | 第51-54页 |
| ·哺乳动物细胞常规培养 | 第51-52页 |
| ·细胞复苏 | 第51页 |
| ·换液 | 第51-52页 |
| ·传代 | 第52页 |
| ·细胞冻存 | 第52页 |
| ·细胞计数 | 第52页 |
| ·哺乳动物细胞的脂质体转染 | 第52-53页 |
| ·倒置荧光显微镜观察荧光 | 第53页 |
| ·重组慢病毒的生产 | 第53页 |
| ·慢病毒滴度鉴定 | 第53页 |
| ·重组慢病毒感染MT-4细胞及慢病毒稳定整合的细胞株制备 | 第53-54页 |
| ·HIV-1病毒的生产及滴度鉴定 | 第54页 |
| ·HIV-1病毒的生产 | 第54页 |
| ·HIV-1病毒的滴度鉴定 | 第54页 |
| ·HIV-1病毒对MT4-miRNA细胞株的感染 | 第54页 |
| ·生化及细胞学检测方法 | 第54-60页 |
| ·酶联免疫吸附分析(ELISA)测定HIV-1 p24抗原活性 | 第54-55页 |
| ·荧光定量PCR检测 | 第55-58页 |
| ·细胞总RNA提取 | 第55页 |
| ·miRNA表达水平检测 | 第55-57页 |
| ·IFN反应检测 | 第57-58页 |
| ·细胞增殖和毒性检测 | 第58页 |
| ·细胞毒性检测 | 第58页 |
| ·细胞增殖检测 | 第58页 |
| ·Dual-Luciferase(?)双萤光素酶报告基因检测系统 | 第58页 |
| ·TZM-b1细胞检测HIV滴度 | 第58-60页 |
| 结果与分析 | 第60-86页 |
| 1.靶向HIV-1 miRNA的设计 | 第60-64页 |
| ·靶向HIV-1基因组siRNA的抑制效率及保守性分析 | 第60-61页 |
| ·将表达siRNA的shRNA结构替换为miRNA结构的设计思路 | 第61-64页 |
| 2.靶向CCR5 miRNA的设计 | 第64-65页 |
| 3.miRNA表达载体的构建 | 第65页 |
| 4.融合有miRNA靶点序列的报告基因表达载体的构建 | 第65-68页 |
| 5.miRNA抑制靶点序列的效果验证 | 第68-70页 |
| ·靶向HIV-1 miRNA抑制效果验证 | 第68-69页 |
| ·靶向CCR5 miRNA抑制效果验证 | 第69-70页 |
| 6.Multi-miRNA表达元件的设计和构建 | 第70-76页 |
| ·Multi-miRNA表达元件的设计思路 | 第70-72页 |
| ·Linker序列的设计思路 | 第72-73页 |
| ·pcDNA3.1+(Bgl Ⅱ-)的构建 | 第73-74页 |
| ·miRNA-linker融合表达载体的构建 | 第74-75页 |
| ·pcDNA3.1-miRNAL表达载体上miRNA表达活性的验证 | 第75页 |
| ·多靶点miRNA表达载体的构建 | 第75-76页 |
| 7.miCVPP元件的二级结构分析 | 第76-77页 |
| 8.pLLK~K-miCVPP慢病毒转移载体的构建 | 第77-79页 |
| 9.pLLK~K-miCVPP对不同亚型HIV-1抑制效果的验证 | 第79页 |
| 10.pLLK~K-miCVPP对膜受体基因CCR5抑制效果的验证 | 第79-80页 |
| 11.pLLK~K-miCVPP抑制特异性分析 | 第80页 |
| 12.Lenti-miCVPP重组慢病毒的组装与鉴定 | 第80-81页 |
| 13.稳定表达miCVPP的MT-4细胞的制备 | 第81-83页 |
| 14.MT4-miCVPP细胞株中miRNA元件的表达分析 | 第83-84页 |
| 15.miCVPP的细胞毒性及细胞增殖分析 | 第84页 |
| 16.miCVPP的干扰素效应分析 | 第84-85页 |
| 17.重组慢病毒介导的miCVPP在MT-4细胞中的抗HIV-1保护性效果 | 第85-86页 |
| 讨论 | 第86-90页 |
| 1.多靶点RNAi联合抑制HIV-1的优势 | 第86页 |
| 2.RNAi抑制HIV-1的靶点选择 | 第86-87页 |
| 3.人工miRNA的设计方法 | 第87-88页 |
| 4.多靶点RNAi元件的构建方法 | 第88页 |
| 5.慢病毒载体的优势 | 第88-90页 |
| 总结与展望 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-111页 |
| 致谢 | 第111页 |
