| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 缩略词表 | 第17-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-27页 |
| 1.1 链霉菌在活性物质中的贡献及潜力 | 第18-19页 |
| 1.2 核糖体工程 | 第19-21页 |
| 1.2.1 核糖体工程简介 | 第19-20页 |
| 1.2.2 rpsL基因及K88E、P91S突变 | 第20-21页 |
| 1.3 基因组编辑技术及CRISPR-Cas9 | 第21-26页 |
| 1.3.1 基因组编辑技术 | 第21-22页 |
| 1.3.2 CRISPR-Cas9 | 第22-23页 |
| 1.3.3 CRISPR-Cas9技术在链霉菌基因组编辑中的应用 | 第23-26页 |
| 1.4 研究目的与意义 | 第26-27页 |
| 第二章 海绵共附生链霉菌基因组编辑CRISPR-Cas9质粒构建 | 第27-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-28页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第27页 |
| 2.1.2 实验质粒 | 第27-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-35页 |
| 2.2.1 化学法制备大肠杆菌Top10感受态制备 | 第28-29页 |
| 2.2.2 rpsL序列获取 | 第29-30页 |
| 2.2.3 spacer克隆 | 第30-33页 |
| 2.2.4 HR模板克隆 | 第33-35页 |
| 2.3 结果与分析 | 第35-42页 |
| 2.3.1 rpsL测序结果 | 第35-36页 |
| 2.3.2 Golden Gate assembly克隆spacer | 第36-38页 |
| 2.3.3 HR模板克隆 | 第38-42页 |
| 第三章 海绵共附生链霉菌基因组编辑 | 第42-58页 |
| 3.1 实验材料 | 第42页 |
| 3.2 实验方法 | 第42-47页 |
| 3.2.1 链霉菌孢子悬液的制备和保存 | 第42页 |
| 3.2.2 野生型菌株抗性检测 | 第42-43页 |
| 3.2.3 质粒转化ET12567/pUZ8002 | 第43-44页 |
| 3.2.4 接合、筛选及质粒自杀 | 第44页 |
| 3.2.5 硫链丝菌素诱导表达 | 第44页 |
| 3.2.6 colony PCR筛选转基因链霉菌 | 第44-45页 |
| 3.2.7 接合子质粒检测实验 | 第45-46页 |
| 3.2.8 RT-PCR检测元件表达情况 | 第46-47页 |
| 3.3 结果与分析 | 第47-57页 |
| 3.3.1 菌株抗性检测 | 第47-48页 |
| 3.3.2 PCR扩增检测质粒转化ET12567/pUZ8002 | 第48-49页 |
| 3.3.3 接合、筛选及质粒自杀 | 第49-52页 |
| 3.3.4 诱导表达实验结果 | 第52页 |
| 3.3.5 colony PCR筛选转基因链霉菌 | 第52-53页 |
| 3.3.6 接合子质粒检测 | 第53-55页 |
| 3.3.7 RT-PCR检测S07接合子Cas9及sgRNA表达情况 | 第55-57页 |
| 3.4 讨论 | 第57-58页 |
| 第四章 天蓝色链霉菌及白色链霉菌基因组编辑 | 第58-81页 |
| 4.1 实验材料 | 第58-59页 |
| 4.1.1 实验菌株及所用培养基 | 第58页 |
| 4.1.2 实验质粒 | 第58-59页 |
| 4.2 实验方法 | 第59-64页 |
| 4.2.1 天蓝色链霉菌和白色链霉菌菌种鉴定 | 第59页 |
| 4.2.2 spacer克隆 | 第59-60页 |
| 4.2.3 HR模板克隆 | 第60页 |
| 4.2.4 链霉菌孢子悬液的制备和保存 | 第60-61页 |
| 4.2.5 接合、筛选及质粒自杀 | 第61页 |
| 4.2.6 硫链丝菌素诱导表达 | 第61页 |
| 4.2.7 Colony PCR筛选转基因链霉菌 | 第61页 |
| 4.2.8 阿布拉霉素浓度对于转化子筛选及生长的影响 | 第61-62页 |
| 4.2.9 半定量RT-PCR检测Cas9及sgRNA表达情况 | 第62-64页 |
| 4.3 结果与分析 | 第64-77页 |
| 4.3.1 天蓝色链霉菌和白色链霉菌菌种鉴定 | 第64-65页 |
| 4.3.2 spacer克隆 | 第65-66页 |
| 4.3.3 HR模板克隆 | 第66-67页 |
| 4.3.4 接合、筛选及质粒自杀 | 第67-69页 |
| 4.3.5 硫链丝菌素诱导表达 | 第69-70页 |
| 4.3.6 colony PCR筛选转基因链霉菌实验结果 | 第70-71页 |
| 4.3.7 阿布拉霉素浓度对于转化子筛选及生长的影响 | 第71-73页 |
| 4.3.8 半定量RT-PCR检测Cas9及sgRNA表达情况 | 第73-77页 |
| 4.4 讨论 | 第77-81页 |
| 第五章 天蓝色链霉菌阳性菌株的活性检测 | 第81-87页 |
| 5.1 耐链霉素检测 | 第81-84页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第81页 |
| 5.1.2 实验方法 | 第81页 |
| 5.1.3 结果与讨论 | 第81-84页 |
| 5.2 抗菌活性检测 | 第84-87页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第84页 |
| 5.2.2 实验方法 | 第84-85页 |
| 5.2.3 结果与讨论 | 第85-87页 |
| 第六章 总结与展望 | 第87-89页 |
| 6.1 总结 | 第87-88页 |
| 6.2 展望 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-96页 |
| 附录 | 第96-100页 |
| 附录1 培养基与主要试剂配制 | 第96-98页 |
| 附录2 试剂与仪器 | 第98-99页 |
| 附表3 主要仪器 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
