| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 主要英文缩写词 | 第11-17页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 第一章 论文综述 | 第18-36页 |
| 1 寨卡病毒综述 | 第18-30页 |
| 1.1 寨卡病毒病原学 | 第18-19页 |
| 1.2 寨卡病毒主要结构蛋白和非结构蛋白 | 第19-20页 |
| 1.3 流行病学特征 | 第20-22页 |
| 1.3.1 流行区域 | 第20-21页 |
| 1.3.2 传播方式 | 第21页 |
| 1.3.2.1 虫媒传播 | 第21页 |
| 1.3.2.2 母婴传播和性接触传播 | 第21页 |
| 1.3.2.3 唾液传播 | 第21页 |
| 1.3.3 易感人群和宿主 | 第21页 |
| 1.3.4 病毒灭活条件 | 第21-22页 |
| 1.4 寨卡病毒感染的临床症状 | 第22页 |
| 1.5 寨卡病毒的诊断 | 第22页 |
| 1.5.1 分子生物学诊断 | 第22页 |
| 1.5.2 血清学诊断 | 第22页 |
| 1.6 寨卡病毒疫苗研究进展 | 第22-25页 |
| 1.6.1 灭活疫苗 | 第22-23页 |
| 1.6.2 DNA疫苗 | 第23页 |
| 1.6.3 mRNA疫苗 | 第23-24页 |
| 1.6.4 嵌合疫苗 | 第24页 |
| 1.6.5 亚蛋白疫苗 | 第24-25页 |
| 1.6.6 重组病毒载体疫苗 | 第25页 |
| 1.6.7 腺病毒疫苗 | 第25页 |
| 1.7 病毒样颗粒系统 | 第25-28页 |
| 1.7.1 细菌表达系统 | 第26页 |
| 1.7.2 酵母表达系统 | 第26-27页 |
| 1.7.3 昆虫杆状病毒表达系统 | 第27页 |
| 1.7.4 哺乳动物表达系统 | 第27-28页 |
| 1.7.5 植物细胞表达系统 | 第28页 |
| 1.7.6 无细胞表达系统 | 第28页 |
| 1.8 病毒样颗粒的特性 | 第28-30页 |
| 2 埃博拉病毒综述 | 第30-36页 |
| 2.1 埃博拉出血热病原学 | 第30-31页 |
| 2.2 埃博拉出血热流行病学 | 第31页 |
| 2.2.1 流行区域 | 第31页 |
| 2.2.2 传播方式 | 第31页 |
| 2.2.3 易感人群和宿主 | 第31页 |
| 2.3 埃博拉出血热临床特征及病理特征 | 第31-32页 |
| 2.3.1 临床症状 | 第31-32页 |
| 2.3.2 病理特征 | 第32页 |
| 2.4 埃博拉病毒疫苗进展 | 第32-35页 |
| 2.4.1 灭活疫苗 | 第32页 |
| 2.4.2 DNA疫苗 | 第32-33页 |
| 2.4.3 病毒样颗粒疫苗 | 第33页 |
| 2.4.4 委内瑞拉马脑炎病毒复制疫苗 | 第33-34页 |
| 2.4.5 腺病毒疫苗 | 第34页 |
| 2.4.6 埃博拉牛痘疫苗 | 第34-35页 |
| 2.5 免疫层析检测技术 | 第35-36页 |
| 2.5.1 胶体金免疫层析技术 | 第35页 |
| 2.5.2 荧光免疫层析技术 | 第35-36页 |
| 第二章 寨卡病毒病毒样颗粒疫苗的制备 | 第36-55页 |
| 1 实验材料 | 第36-39页 |
| 1.1 实验仪器 | 第36页 |
| 1.2 实验试剂 | 第36-37页 |
| 1.3 菌株 | 第37页 |
| 1.4 常用缓冲溶液 | 第37-39页 |
| 2 实验方法 | 第39-46页 |
| 2.1 重组质粒的构建 | 第39页 |
| 2.2 重组质粒的线性化 | 第39页 |
| 2.3 重组质粒的提纯 | 第39-40页 |
| 2.4 毕赤酵母X33感受态的制备 | 第40页 |
| 2.5 毕赤酵母的电转化 | 第40-41页 |
| 2.6 高抗性重组菌株的筛选 | 第41页 |
| 2.7 阳性克隆的鉴定 | 第41-42页 |
| 2.7.1 菌液PCR鉴定 | 第41-42页 |
| 2.7.1.1 毕赤酵母细胞的裂解及DNA提取 | 第41-42页 |
| 2.7.1.2 PCR扩增 | 第42页 |
| 2.7.2 DNA测序 | 第42页 |
| 2.8 重组酵母菌株的诱导表达 | 第42-43页 |
| 2.9 重组酵母诱导表达条件的优化 | 第43页 |
| 2.9.1 诱导表达时间的优化 | 第43页 |
| 2.9.2 诱导温度的优化 | 第43页 |
| 2.9.3 甲醇诱导剂量的优化 | 第43页 |
| 2.10 重组酵母菌的发酵培养 | 第43-44页 |
| 2.11 重组酵母表达重组蛋白的鉴定 | 第44页 |
| 2.12 目的蛋白的纯化 | 第44-45页 |
| 2.13 Superdex 75~(TM)分子筛层析进一步纯化 | 第45页 |
| 2.14 目的蛋白SDS-PAGE和western Blot鉴定 | 第45-46页 |
| 2.15 蛋白浓度测定 | 第46页 |
| 3 实验结果 | 第46-52页 |
| 3.1 高抗性重组菌株的筛选 | 第46-47页 |
| 3.2 pPICZA/PrM/E重组质粒菌液PCR及测序鉴定 | 第47页 |
| 3.3 重组蛋白表达形式的鉴定 | 第47-48页 |
| 3.4 重组蛋白表达条件的探索 | 第48-50页 |
| 3.4.1 诱导表达时间的优化 | 第48-49页 |
| 3.4.2 诱导表达温度的优化 | 第49-50页 |
| 3.4.3 甲醇诱导剂量的优化 | 第50页 |
| 3.5 重组蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| 3.6 Superdex 75~(TM)分子筛层析纯化蛋白 | 第51-52页 |
| 3.7 重组蛋白浓度测定 | 第52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 4.1 Zika PrM/Env蛋白的优势 | 第52-53页 |
| 4.2 表达系统的选择 | 第53页 |
| 4.3 目的蛋白的纯化 | 第53-54页 |
| 5 小结 | 第54-55页 |
| 第三章 寨卡病毒病毒样颗粒疫苗组装、鉴定 | 第55-64页 |
| 1 实验材料 | 第55页 |
| 2 实验方法 | 第55-56页 |
| 2.1 病毒样颗粒疫苗组装 | 第55-56页 |
| 2.1.1 离子强度对VLP形成的影响 | 第55页 |
| 2.1.2 pH对VLP形成的影响 | 第55-56页 |
| 2.2 病毒样颗粒疫苗鉴定 | 第56页 |
| 2.2.1 VLP的特点及鉴定 | 第56页 |
| 2.2.2 动态光散射(DLS)鉴定 | 第56页 |
| 2.2.3 透射电子显微镜电镜(TEM)鉴定 | 第56页 |
| 3 实验结果 | 第56-62页 |
| 3.1 动态光散射结果 | 第56-60页 |
| 3.1.1 离子强度对VLP形成的影响 | 第56-58页 |
| 3.1.2 pH对VLP形成的影响 | 第58-60页 |
| 3.2 透射电子显微镜结果 | 第60-62页 |
| 3.2.1 离子强度对VLP形成的影响 | 第60-61页 |
| 3.2.2 pH对VLP形成的影响 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-63页 |
| 5 小结 | 第63-64页 |
| 第四章 ZIKA病毒样颗粒疫苗的小鼠实验免疫研究 | 第64-75页 |
| 1 实验材料 | 第64-65页 |
| 1.1 细胞与病毒 | 第64页 |
| 1.2 免疫原 | 第64页 |
| 1.3 实验动物 | 第64页 |
| 1.4 实验仪器 | 第64页 |
| 1.5 实验试剂 | 第64-65页 |
| 2 实验方法 | 第65-69页 |
| 2.1 小鼠免疫 | 第65-66页 |
| 2.1.1 Balb/c小鼠 | 第65页 |
| 2.1.2 A129小鼠 | 第65-66页 |
| 2.2 小鼠攻毒 | 第66页 |
| 2.3 细胞复苏、传代、冻存 | 第66-67页 |
| 2.3.1 vero细胞复苏 | 第66页 |
| 2.3.2 vero细胞传代 | 第66-67页 |
| 2.3.3 vero细胞冻存 | 第67页 |
| 2.4 病毒扩繁 | 第67页 |
| 2.5 病毒TCID50测定 | 第67-68页 |
| 2.6 ELISA检测 | 第68页 |
| 2.6.1 免疫效价检测 | 第68页 |
| 2.6.2 免疫原性检测 | 第68页 |
| 2.7 中和抗体检测 | 第68-69页 |
| 2.8 ELISPOT检测 | 第69页 |
| 3 实验结果 | 第69-73页 |
| 3.1 小鼠体重变化 | 第69-70页 |
| 3.2 攻毒存活率 | 第70页 |
| 3.3 体液免疫反应评价 | 第70-72页 |
| 3.3.1 结合抗体检测 | 第70-71页 |
| 3.3.2 中和抗体检测 | 第71-72页 |
| 3.4 ELISPOT检测和胞内细胞因子染色 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-74页 |
| 5 小结 | 第74-75页 |
| 第五章 埃博拉病毒胶体碳免疫层析检测方法的建立 | 第75-84页 |
| 1 实验材料 | 第75-76页 |
| 1.1 实验仪器 | 第75页 |
| 1.2 胶体碳实验试剂 | 第75-76页 |
| 1.3 胶体碳试纸条用液 | 第76页 |
| 2 实验方法 | 第76-79页 |
| 2.1 VLP的制备 | 第76页 |
| 2.2 重组蛋白的制备 | 第76页 |
| 2.3 抗体的制备 | 第76页 |
| 2.4 单抗ELISA检测 | 第76-77页 |
| 2.5 胶体碳试纸条的制备 | 第77-78页 |
| 2.5.1 胶体碳标记抗体 | 第77页 |
| 2.5.2 胶体碳标记垫 | 第77-78页 |
| 2.5.3 样品垫 | 第78页 |
| 2.5.4 检测线及质控线 | 第78页 |
| 2.5.5 试纸条的组装与结果判定标准 | 第78页 |
| 2.6 试纸条性能评价 | 第78-79页 |
| 2.6.1 特异性检测 | 第78-79页 |
| 2.6.2 灵敏性检测 | 第79页 |
| 3 实验结果 | 第79-83页 |
| 3.1 重组蛋白纯化 | 第79-80页 |
| 3.2 抗体纯化 | 第80页 |
| 3.3 单抗ELISA检测 | 第80-81页 |
| 3.4 试纸条的组装和结果判定 | 第81页 |
| 3.5 试纸条特异性检测 | 第81-82页 |
| 3.6 试纸条灵敏性检测 | 第82-83页 |
| 4 讨论 | 第83页 |
| 5 小结 | 第83-84页 |
| 结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-92页 |
| 附录1 重组质粒pPICZA/PrM/E合成序列 | 第92-93页 |
| 附录2 重组质粒pPICZA/PrM/E(△TM)合成序列 | 第93-94页 |
| 附录3 重组质粒pPICZA/PrM/E(△stem)合成序列 | 第94-95页 |
| 附录4 ZikaPrM/Env(△stem)N端测序 | 第95-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 个人简历 | 第99-100页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第100页 |
