| 致谢 | 第4-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-24页 |
| 1.1 农作物秸秆在食用菌栽培中的应用 | 第11-15页 |
| 1.1.1 我国农作物秸秆的资源状况 | 第11页 |
| 1.1.2 秸秆的基本结构 | 第11-12页 |
| 1.1.3 食用菌栽培和秸秆利用的关系 | 第12-13页 |
| 1.1.4 糙皮侧耳在秸秆降解中的应用 | 第13-15页 |
| 1.1.4.1 糙皮侧耳的发展概况及推广意义 | 第13页 |
| 1.1.4.2 糙皮侧耳在秸秆降解中的应用 | 第13-15页 |
| 1.2 双孢蘑菇覆土出菇机理的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.1 | 第15-16页 |
| 1.2.2 乙烯生物合成途径的类型 | 第16-17页 |
| 1.3 真菌基因功能的研究方法及应用 | 第17-19页 |
| 1.3.1 基因敲除技术 | 第17-18页 |
| 1.3.1.1 基因敲除技术 | 第17-18页 |
| 1.3.1.2 基因敲除技术在真菌中的应用 | 第18页 |
| 1.3.2 RNAi技术 | 第18-19页 |
| 1.3.2.1 RNAi的作用机制和特征 | 第18-19页 |
| 1.3.2.2 RNAi在真菌中的应用 | 第19页 |
| 1.4 食用菌遗传转化研究进展 | 第19-22页 |
| 1.4.1 平菇的转化方法 | 第20-21页 |
| 1.4.1.1 PEG-CaCl2介导的原生质体转化法 | 第20页 |
| 1.4.1.2 电激转化法 | 第20页 |
| 1.4.1.3 基因枪法 | 第20页 |
| 1.4.1.4 限制性内切酶介导的DNA整合法(REMI) | 第20页 |
| 1.4.1.5 农杆菌介导转化法 | 第20页 |
| 1.4.1.6 脂质体介导转化法 | 第20-21页 |
| 1.4.2 食用菌遗传转化的筛选标记 | 第21页 |
| 1.4.3 食用菌常用的启动子 | 第21-22页 |
| 1.5 研究的目的和意义 | 第22-24页 |
| 1.5.1 构建平菇漆酶工程菌株的意义 | 第22页 |
| 1.5.2 构建双孢蘑菇ACO基因工程菌株的意义 | 第22-24页 |
| 第二章 糙皮侧耳漆酶基因poxc启动子替代 | 第24-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-25页 |
| 2.1.1 菌株和载体 | 第24页 |
| 2.1.2 试剂和药品 | 第24页 |
| 2.1.3 培养基配方 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-33页 |
| 2.2.1 构建糙皮侧耳漆酶POXC基因的工程菌株的技术路线 | 第25页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第25页 |
| 2.2.3 CTAB法提取糙皮侧耳的基因组DNA | 第25-26页 |
| 2.2.4 2号质粒的提取 | 第26页 |
| 2.2.4.1 质粒宿主菌的活化与培养 | 第26页 |
| 2.2.4.2 碱裂解法提取质粒DNA | 第26页 |
| 2.2.5 同源重组片段的构建 | 第26-28页 |
| 2.2.6 PCR产物回收纯化 | 第28页 |
| 2.2.7 脂质体的转化方法 | 第28-29页 |
| 2.2.8 转化子的筛选与鉴定 | 第29-32页 |
| 2.2.8.1 潮霉素筛选与PCR鉴定 | 第29页 |
| 2.2.8.2 拟转化子菌丝的遗传稳定性观察 | 第29页 |
| 2.2.8.3 拟转化子的显色验证 | 第29页 |
| 2.2.8.4 拟转化子生长速度的测定 | 第29页 |
| 2.2.8.5 拟转化子的酶活测定 | 第29-30页 |
| 2.2.8.6 拟转化子的半定量检测 | 第30-32页 |
| 2.2.9 拟转化子的栽培验证 | 第32页 |
| 2.2.10 栽培料中三素含量的检测 | 第32-33页 |
| 2.3 结果与分析 | 第33-40页 |
| 2.3.1 平菇基因组DNA的提取 | 第33页 |
| 2.3.2 各个目的片段的PCR产物 | 第33-35页 |
| 2.3.2.1 脂质体转化平菇天达300 | 第34页 |
| 2.3.2.2 PCR鉴定阳性转化子 | 第34-35页 |
| 2.3.3 转化子的筛选与鉴定 | 第35-38页 |
| 2.3.3.1 转化子在PDA固体平板上的表型稳定性分析 | 第35-36页 |
| 2.3.3.2 转化子的显色验证 | 第36页 |
| 2.3.3.3 菌丝生长速度测定结果 | 第36-37页 |
| 2.3.3.4 转化子的酶活测定 | 第37页 |
| 2.3.3.5 转化子的半定量检测 | 第37-38页 |
| 2.3.4 栽培试验 | 第38-39页 |
| 2.3.5 栽培料中三素含量的检测 | 第39-40页 |
| 第三章 双孢蘑菇ACO基因的分子生物学研究 | 第40-57页 |
| 3.1 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.1.1 菌种和质粒 | 第40页 |
| 3.1.2 培养基的配制 | 第40页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第40-41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-48页 |
| 3.2.1 RNAi真核表达载体pBHg-ACO构建 | 第41页 |
| 3.2.2 双孢蘑菇AS2796ACO基因的克隆 | 第41-43页 |
| 3.2.2.1 引物设计 | 第41页 |
| 3.2.2.2 双孢蘑菇AS2796基因组总RNA提取 | 第41-42页 |
| 3.2.2.3 目的基因的PCR扩增 | 第42页 |
| 3.2.2.4 PCR回收产物与pMD19-T克隆载体连接 | 第42页 |
| 3.2.2.5 酶连产物转化感受态细胞(JM109) | 第42-43页 |
| 3.2.2.6 重组质粒提取、鉴定并鉴定 | 第43页 |
| 3.2.3 ACO基因真核表达载体pBHg-dsACO的构建 | 第43-46页 |
| 3.2.3.1 引物设计及PCR扩增 | 第43-44页 |
| 3.2.3.2 酶切反应与酶连反应 | 第44-45页 |
| 3.2.3.3 RNAi载体的构建 | 第45页 |
| 3.2.3.4 碱裂解法提取质粒 | 第45页 |
| 3.2.3.5 重组质粒的鉴定 | 第45-46页 |
| 3.2.4 脂质体的转化方法 | 第46页 |
| 3.2.5 转化子的筛选与鉴定 | 第46-48页 |
| 3.2.5.1 高浓度潮霉素的抗性筛选 | 第46页 |
| 3.2.5.2 PCR扩增目的基因验证 | 第46页 |
| 3.2.5.3 ACO基因的半定量表达验证 | 第46-47页 |
| 3.2.5.4 双孢蘑菇产生乙烯的测定方法 | 第47-48页 |
| 3.2.5.5 ACC氧化酶酶活性测定 | 第48页 |
| 3.3 结果与分析 | 第48-57页 |
| 3.3.1 RNA的质量检测 | 第48页 |
| 3.3.2 双孢蘑菇ACO基因的克隆与序列分析 | 第48-49页 |
| 3.3.2.1 RT-PCR产物检测 | 第48页 |
| 3.3.2.2 序列分析及同源性比对 | 第48-49页 |
| 3.3.3 cDNA目的片段的RT-PCR扩增鉴定 | 第49-50页 |
| 3.3.4 载体验证 | 第50-52页 |
| 3.3.4.1 载体的酶切验证 | 第50页 |
| 3.3.4.2 克隆载体pDM19-Tsimple+dsACO发夹结构测序结果 | 第50-52页 |
| 3.3.5 脂质体的转化方法 | 第52-53页 |
| 3.3.5.1 共培养时间与萌发率 | 第52页 |
| 3.3.5.2 脂质体转化双孢蘑菇As2796 | 第52-53页 |
| 3.3.6 转化子的筛选与鉴定 | 第53-57页 |
| 3.3.6.1 潮霉素抗性验证 | 第53-54页 |
| 3.3.6.2 ACO基因的半定量验证 | 第54-55页 |
| 3.3.6.3 转基因菌株在PDA培养基中乙烯含量的测定 | 第55-56页 |
| 3.3.6.4 转基因菌株在PDA培养基中ACC酶活的测定 | 第56-57页 |
| 第四章 结果与讨论 | 第57-60页 |
| 4.1 遗传转化方法的选择 | 第57页 |
| 4.2 糙皮侧耳漆酶基因poxc启动子替代 | 第57-58页 |
| 4.3 双孢蘑菇ACO基因的分子生物学研究 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-68页 |
| 英文摘要 | 第68-69页 |
