| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 英文缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-45页 |
| 1.1 蛋白质组学概述 | 第15-16页 |
| 1.2. 蛋白质组学的研究方法 | 第16-27页 |
| 1.2.1 荧光双向差异电泳技术(2D-DIGE) | 第17-19页 |
| 1.2.2 同位素亲和标签技术（ICAT） | 第19-20页 |
| 1.2.3 细胞培养稳定同位素技术（SILAC） | 第20-22页 |
| 1.2.4 可溶性聚合物同位素技术（SoPIL） | 第22-23页 |
| 1.2.5 同位素的相对和绝对定量技术（iTRAQ） | 第23-27页 |
| 1.3 毕赤酵母蛋白质组学的研究 | 第27-39页 |
| 1.3.1 毕赤酵母简介 | 第27-28页 |
| 1.3.2 毕赤酵母的优势 | 第28-29页 |
| 1.3.3 毕赤酵母存在的问题和解决方案 | 第29-30页 |
| 1.3.4 毕赤酵母高效分泌表达外源蛋白的主要策略 | 第30-39页 |
| 1.4 木聚糖酶及其在毕赤酵母中的表达 | 第39-42页 |
| 1.4.1 木聚糖酶简介 | 第39-40页 |
| 1.4.2 木聚糖酶在造纸工业中的应用 | 第40-41页 |
| 1.4.3 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达 | 第41-42页 |
| 1.5 本课题研究背景与研究意义 | 第42-43页 |
| 1.6 本课题的主要研究内容 | 第43-45页 |
| 第二章 高拷贝木聚糖酶表达载体的构建及基因拷贝数对酶在毕赤酵母中分泌表达的影响 | 第45-71页 |
| 2.1 引言 | 第45-46页 |
| 2.2 材料与设备 | 第46-49页 |
| 2.2.1 质粒、菌株与引物 | 第46-47页 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 | 第47页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第47-48页 |
| 2.2.4 培养基与试剂 | 第48-49页 |
| 2.3 实验方法 | 第49-61页 |
| 2.3.1 单拷贝载体 pHKa-xyn10 的构建 | 第49-51页 |
| 2.3.2 通过串联表达盒构建多拷贝重组质粒的构建 | 第51-53页 |
| 2.3.3 利用 NTS 构建多拷贝表达载体的方法 | 第53-54页 |
| 2.3.4 毕赤酵母的转化和重组菌株的筛选 | 第54-56页 |
| 2.3.5 毕赤酵母的转化子拷贝数的鉴定 | 第56-57页 |
| 2.3.6 不同拷贝数菌株的发酵产酶比较 | 第57-59页 |
| 2.3.7 多拷贝菌株 xyn10 基因转录水平分析 | 第59-61页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第61-69页 |
| 2.4.1 两种方法构建多拷贝表达质粒与鉴定 | 第61-62页 |
| 2.4.2 多拷贝木聚糖酶重组菌的筛选 | 第62-64页 |
| 2.4.3 重组毕赤酵母拷贝数的鉴定 | 第64-67页 |
| 2.4.4 拷贝数对木聚糖酶产酶的影响分析 | 第67-69页 |
| 2.4.5 不同拷贝数菌株中目的基因转录水平的差异比较 | 第69页 |
| 2.5 本章小结 | 第69-71页 |
| 第三章 过量表达内质网蛋白折叠相关基因对毕赤酵母分泌木聚糖酶的影响 | 第71-87页 |
| 3.1 引言 | 第71-72页 |
| 3.2 材料与设备 | 第72-74页 |
| 3.2.1 质粒、菌株与引物 | 第72-73页 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 | 第73-74页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第74页 |
| 3.2.4 培养基与试剂 | 第74页 |
| 3.3 实验方法 | 第74-77页 |
| 3.3.1 胞内表达重组质粒的构建 | 第74-75页 |
| 3.3.2 转化大肠杆菌感受态细胞 | 第75页 |
| 3.3.3 大肠杆菌重组子筛选双酶切鉴定 | 第75页 |
| 3.3.4 毕赤酵母重组菌株构建 | 第75-76页 |
| 3.3.5 重组菌株与内质网蛋白折叠相关基因转录水平的分析 | 第76页 |
| 3.3.6 2L 发酵罐进行高密度发酵 | 第76-77页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第77-85页 |
| 3.4.1 重组质粒构建与鉴定 | 第77-78页 |
| 3.4.2 毕赤酵母重组菌株的筛选 | 第78-79页 |
| 3.4.3 过表达与内质网蛋白折叠基因对四拷贝菌株发酵产酶的影响 | 第79-80页 |
| 3.4.4 过表达与内质网蛋白折叠基因对七拷贝菌株发酵产酶的影响 | 第80页 |
| 3.4.5 过表达 HAC1 基因对不同拷贝数菌株发酵产酶的影响 | 第80-83页 |
| 3.4.6 G4-H 菌株在 2L 发酵罐的产酶比较 | 第83-85页 |
| 3.5 本章小结 | 第85-87页 |
| 第四章 基于 iTRAQ 技术的高表达外源蛋白的毕赤酵母细胞的蛋白质组分析 | 第87-119页 |
| 4.1 引言 | 第87-88页 |
| 4.2 材料与设备 | 第88-90页 |
| 4.2.1 质粒、菌株与引物 | 第88-89页 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 | 第89页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第89-90页 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 | 第90页 |
| 4.3 实验方法 | 第90-97页 |
| 4.3.1 重组毕赤酵母的培养 | 第90页 |
| 4.3.2 毕赤酵母胞内蛋白的提取 | 第90-91页 |
| 4.3.3 SDS-PAGE 和 Western blot 检测目的蛋白 | 第91-92页 |
| 4.3.4 蛋白样品的烷基化处理和 Bradford 测定蛋白浓度 | 第92-93页 |
| 4.3.5 蛋白质的消化及 iTRAQ 8 plex 试剂标记肽段 | 第93页 |
| 4.3.6 标记肽段的强阳离子交换柱（SCX）分离 | 第93-94页 |
| 4.3.7 质谱数据的生物信息学分析 | 第94-97页 |
| 4.3.8 RT-PCR 验证差异表达蛋白质 | 第97页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第97-117页 |
| 4.4.1 重组菌株的发酵产酶及细胞胞内蛋白质组分析样品的制备 | 第97-99页 |
| 4.4.2 蛋白样品 HPLC-MS/MS 上样前处理和定量分析 | 第99-100页 |
| 4.4.3 iTRAQ 蛋白质组鉴定的谱图在毕赤酵母基因组中的匹配统计 | 第100页 |
| 4.4.4 蛋白质组整体数据的分析 | 第100-104页 |
| 4.4.5 不同菌株发酵产酶条件下细胞内的差异蛋白分析 | 第104-106页 |
| 4.4.6 差异蛋白参与的 Pathway 代谢通路注释 | 第106-108页 |
| 4.4.7 外源蛋白分泌表达诱导的 UPR 机制的研究 | 第108-113页 |
| 4.4.8 外源蛋白分泌表达对碳源、能源及氨基酸代谢的影响 | 第113-116页 |
| 4.4.9 RT-PCR 转录水平对差异蛋白的验证 | 第116-117页 |
| 4.5 本章小结 | 第117-119页 |
| 结论与展望 | 第119-123页 |
| 结论 | 第119-120页 |
| 本论文创新点 | 第120页 |
| 展望 | 第120-123页 |
| 参考文献 | 第123-143页 |
| 附录 | 第143-158页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第158-159页 |
| 致谢 | 第159-160页 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 | 第160页 |
