| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略语 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-26页 |
| 1 RISC复合体及其功能 | 第16-17页 |
| 2 AGO蛋白家族及其功能研究 | 第17-20页 |
| 2.1 AGO蛋白家族结构特征 | 第17-18页 |
| 2.2 AGO蛋白家族的分类 | 第18页 |
| 2.3 AGO蛋白家族的功能研究 | 第18-20页 |
| 2.3.1 Ago亚家族蛋白与miRNA | 第19-20页 |
| 2.3.2 Ago亚家族蛋白与siRNA | 第20页 |
| 2.3.3 PIWI亚家族蛋白与piRNA | 第20页 |
| 3 AGO免疫沉淀法筛选和鉴定miRNA靶基因 | 第20-26页 |
| 3.1 miRNA靶基因鉴定的研究现状 | 第20-22页 |
| 3.1.1 生物信息学方法 | 第21页 |
| 3.1.2 实验筛选方法 | 第21-22页 |
| 3.2 AGO免疫沉淀法是miRNA靶基因筛选和鉴定的有效方法 | 第22-26页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第26-29页 |
| 1 实验目的、意义 | 第26页 |
| 2 实验内容 | 第26-28页 |
| 3 实验流程图 | 第28-29页 |
| 第三章 生物信息学分析 | 第29-39页 |
| 1 序列与工具 | 第29页 |
| 1.1 序列 | 第29页 |
| 1.2 工具 | 第29页 |
| 2 方法 | 第29-30页 |
| 3 结果 | 第30-37页 |
| 3.1 BmAGO1基因的序列分析 | 第30-32页 |
| 3.2 BmAGO1抗原表位区分析 | 第32页 |
| 3.3 BmAGO1蛋白的疏水性分析 | 第32-33页 |
| 3.4 BmAGO1蛋白的跨膜分析 | 第33页 |
| 3.5 BmAGO1蛋白的信号肽分析 | 第33-34页 |
| 3.6 BmAGO1蛋白的亚细胞定位分析 | 第34页 |
| 3.7 BmAGO1蛋白的二级结构预测 | 第34-35页 |
| 3.8 BmAGO1蛋白的三级结构预测 | 第35页 |
| 3.9 氨基酸序列同源性分析 | 第35-37页 |
| 4 讨论 | 第37-39页 |
| 第四章 家蚕Kago-1原核表达与抗体制备 | 第39-60页 |
| 1 材料与试剂 | 第39-44页 |
| 1.1 菌种 | 第39页 |
| 1.2 试剂 | 第39页 |
| 1.3 主要试剂的配置 | 第39-44页 |
| 2 方法 | 第44-55页 |
| 2.1 家蚕组织总RNA的提取和cDNA的合成 | 第44-45页 |
| 2.1.1 家蚕BmN细胞RNA的提取 | 第44页 |
| 2.1.2 cDNA第一链的合成 | 第44-45页 |
| 2.2 重组质粒pET-28a-Kago-1的构建 | 第45-50页 |
| 2.2.1 Kago-1基因的PCR扩增 | 第45-46页 |
| 2.2.2 Kago-1基因的纯化回收和pET-28a的双酶切 | 第46-47页 |
| 2.2.3 连接反应 | 第47页 |
| 2.2.4 用CaCl_2法制备E.coli TG1、BL21 (DE3)感受态细胞 | 第47页 |
| 2.2.5 连接产物的转化 | 第47-48页 |
| 2.2.6 重组质粒提取 | 第48页 |
| 2.2.7 重组质粒的PCR和双酶切鉴定 | 第48-49页 |
| 2.2.8 重组质粒的测序鉴定 | 第49-50页 |
| 2.2.9 重组质粒的转化与鉴定 | 第50页 |
| 2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第50-52页 |
| 2.3.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第50页 |
| 2.3.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第50-51页 |
| 2.3.3 包涵体的洗涤和溶解 | 第51-52页 |
| 2.3.4 His柱亲和层析纯化重组蛋白 | 第52页 |
| 2.4 抗体的制备 | 第52-53页 |
| 2.4.1 抗原的制备 | 第52-53页 |
| 2.4.2 免疫新西兰大白兔 | 第53页 |
| 2.4.3 多克隆抗血清的制备 | 第53页 |
| 2.5 抗体特异性的Western blotting鉴定 | 第53-54页 |
| 2.6 间接ELISA法测定抗体效价 | 第54-55页 |
| 3 结果 | 第55-58页 |
| 3.1 PCR扩增目的片段 | 第55页 |
| 3.2 重组质粒pET-28a-Kago-1鉴定 | 第55-56页 |
| 3.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第56-57页 |
| 3.5 融合蛋白的Western blotting检测 | 第57页 |
| 3.6 多抗的效价检测 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 第五章 家蚕BmAGO1蛋白的表达谱分析和RNA干扰研究 | 第60-72页 |
| 1 材料与试剂 | 第60-62页 |
| 1.1 材料 | 第60页 |
| 1.2 试剂 | 第60页 |
| 1.3 试剂配制 | 第60-62页 |
| 2 方法 | 第62-65页 |
| 2.1 家蚕各时期及各组织蛋白提取 | 第62页 |
| 2.2 BmAGO1蛋白在家蚕各发育时期的表达分析 | 第62页 |
| 2.3 BmAGO1在五龄幼虫各组织中的表达分析 | 第62页 |
| 2.4 亚细胞定位 | 第62-63页 |
| 2.5 RNA干扰研究 | 第63-65页 |
| 2.5.1 dsRNA的合成 | 第63页 |
| 2.5.2 体外转录RNA | 第63-64页 |
| 2.5.3 RNAi-dsRNA的转染 | 第64页 |
| 2.5.4 MTT检测细胞活力 | 第64-65页 |
| 2.5.5 流式细胞仪检测 | 第65页 |
| 3 结果 | 第65-70页 |
| 3.1 家蚕BmAGO1各发育时期表达情况 | 第65-66页 |
| 3.2 五龄幼虫各组织中BmAGO1表达情况 | 第66页 |
| 3.3 BmAGO1蛋白的亚细胞定位 | 第66-67页 |
| 3.4 BmAGO1基因的RNA干扰研究 | 第67-70页 |
| 3.4.1 dsRNA的合成 | 第67-68页 |
| 3.4.2 Kago-1 RNAi的MTT检测结果分析 | 第68-69页 |
| 3.4.3 流式细胞仪检测 | 第69-70页 |
| 4 讨论 | 第70-72页 |
| 第六章 BmAGO1蛋白结合RNA的分离与潜在miRNA靶基因的鉴定 | 第72-98页 |
| 1 材料与试剂 | 第72-74页 |
| 1.1 材料 | 第72页 |
| 1.2 试剂及仪器 | 第72-73页 |
| 1.3 试剂配方 | 第73-74页 |
| 2 方法 | 第74-84页 |
| 2.1 重组质粒pIEx- 1-GFP的构建 | 第74-76页 |
| 2.1.1 GFP基因的PCR扩增 | 第74-75页 |
| 2.1.2 GFP和pIEx-1载体的纯化回收与双酶切 | 第75-76页 |
| 2.2 细胞培养与冻存、复苏 | 第76页 |
| 2.2.1 家蚕细胞BmN贴壁培养 | 第76页 |
| 2.2.2 细胞冻存 | 第76页 |
| 2.2.3 细胞复苏 | 第76页 |
| 2.3 重组质粒pIEx-1-GFP通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞 | 第76-77页 |
| 2.4 pIEx-1-BmAGO1真核重组表达载体的构建 | 第77-79页 |
| 2.4.1 BmAGO1基因的PCR扩增 | 第77-78页 |
| 2.4.2 末端平滑BmAGO1片段的3'末端加"A'反应 | 第78页 |
| 2.4.3 PCR产物与PCR 2.1-T载体的连接与转化 | 第78页 |
| 2.4.4 重组质粒PCR2.1-T-BmAGO1和pIEx-1的双酶切 | 第78-79页 |
| 2.4.5 BmAGO1与pIEx-1的连接与转化 | 第79页 |
| 2.5 BmAGO1蛋白在家蚕BmN细胞中的表达 | 第79-80页 |
| 2.6 免疫共沉淀分离BmAGO1结合的RNA | 第80-82页 |
| 2.6.1 家蚕组织中天然BmAGO1蛋白的免疫沉淀 | 第80页 |
| 2.6.2 家蚕细胞中重组HIS融合BmAGO1蛋白的免疫共沉淀 | 第80-81页 |
| 2.6.3 RNA/蛋白复合物中总RNA的提取 | 第81-82页 |
| 2.6.4 cDNA第一链的合成 | 第82页 |
| 2.7 BmAG01结合RNA中miRNA靶基因的鉴定 | 第82-84页 |
| 2.7.1 3对已知潜在miRNA靶基因荧光定量PCR引物的设计 | 第82-83页 |
| 2.7.2 荧光定量PCR | 第83-84页 |
| 2.7.3 荧光定量PCR数据分析 | 第84页 |
| 3 结果 | 第84-94页 |
| 3.1 重组HIS-BmAGO1蛋白结合RNA的分离与鉴定 | 第84-92页 |
| 3.1.1 家蚕真核表达载体的确定与表达条件的优化 | 第84-87页 |
| 3.1.1.1 重组载体pIEx-GFP的构建 | 第84-85页 |
| 3.1.1.2 pIEx-1-GFP重组载体转染条件的优化与GFP的真核表达 | 第85-87页 |
| 3.1.2 BmAGO1蛋白在家蚕细胞中的表达 | 第87-89页 |
| 3.1.2.1 pIEx-BmAGO1真核重组表达载体的构建 | 第87-88页 |
| 3.1.2.2 BmAGO 1蛋白在家蚕细胞中的真核表达、纯化与鉴定 | 第88-89页 |
| 3.1.3 重组HIS-BmAGO1结合RNA的免疫共沉淀 | 第89-90页 |
| 3.1.4 重组HIS-BmAGO1结合RNA的分离与cDNA的合成 | 第90页 |
| 3.1.5 重组HIS- BmAGO1结合RNA中miRNA靶基因的鉴定 | 第90-92页 |
| 3.1.5.1 qRT-PCR中β-actin和三个基因的扩增曲线和溶解曲线 | 第90-91页 |
| 3.1.5.2 荧光定量PCR结果 | 第91-92页 |
| 3.2 家蚕组织中天然BmAGO1结合RNA的分离与鉴定 | 第92-94页 |
| 3.2.1 家蚕组织中天然BmAGO1结合RNA的免疫共沉淀 | 第92页 |
| 3.2.2 家蚕组织中天然BmAGO1结合RNA的分离与cDNA的合成 | 第92页 |
| 3.2.3 家蚕组织中天然BmAGO1结合RNA中miRNA靶基因的鉴定 | 第92-94页 |
| 3.2.3.1 荧光定量PCR中β-actin和三个基因的扩增曲线和溶解曲线 | 第93页 |
| 3.2.3.2 荧光定量PCR结果 | 第93-94页 |
| 4 讨论 | 第94-98页 |
| 结论 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
