| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-32页 |
| 1.1 引言 | 第13页 |
| 1.2 嗜热醇脱氢酶 | 第13-15页 |
| 1.3 酶作为生物催化剂的缺陷及改善的措施 | 第15-22页 |
| 1.3.1 改善包涵体的方法[26.27] | 第15-18页 |
| 1.3.2 氧失活现象及改造的方法 | 第18-19页 |
| 1.3.3 辅酶倾向性的改造 | 第19-22页 |
| 1.4 蛋白质突变体库的构建 | 第22-23页 |
| 1.4.1 定向进化 | 第22-23页 |
| 1.4.2 理性设计 | 第23页 |
| 1.5 突变库的转化及筛选方法的构建 | 第23-26页 |
| 1.5.1 突变库的转化 | 第23-24页 |
| 1.5.2 突变库筛选方法的构建 | 第24-26页 |
| 1.5.2.1 显色法 | 第24-25页 |
| 1.5.2.2 高通量酶活检测 | 第25-26页 |
| 1.5.2.3 基于辅酶荧光的菌落筛选方法 | 第26页 |
| 1.6 本论文的研究背景、内容及意义 | 第26-27页 |
| 参考文献 | 第27-32页 |
| 第二章 烯醇脱氢酶重组菌的构建及其酶学性质的表征 | 第32-56页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 实验材料 | 第33-36页 |
| 2.2.1 菌种及质粒载体 | 第33页 |
| 2.2.2 试剂与耗材 | 第33页 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 | 第33-34页 |
| 2.2.4 缓冲液 | 第34页 |
| 2.2.5 主要仪器 | 第34-36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-41页 |
| 2.3.1 YsADH重组蛋白的诱导表达 | 第36页 |
| 2.3.2 YsADH重组蛋白的纯化 | 第36页 |
| 2.3.3 重组酶活力的测定及蛋白浓度的测定 | 第36-37页 |
| 2.3.4 YsADH重组酶的酶学性质 | 第37-38页 |
| 2.3.4.1 底物特异性 | 第37页 |
| 2.3.4.2 最适温度 | 第37页 |
| 2.3.4.3 最适pH | 第37页 |
| 2.3.4.4 重组酶动力学常数测定 | 第37页 |
| 2.3.4.5 有机溶剂对重组酶活力的影响 | 第37-38页 |
| 2.3.4.6 金属离子对重组酶活力的影响 | 第38页 |
| 2.3.4.7 重组蛋白天然分子量的检测 | 第38页 |
| 2.3.5. YsADH的可溶性表达 | 第38-41页 |
| 2.3.5.1 质粒的提取 | 第38页 |
| 2.3.5.2 重组蛋白在含还氧硫蛋白的大肠杆菌宿主中的表达 | 第38页 |
| 2.3.5.3 重组蛋白在毕赤酵母酵母中的表达 | 第38-39页 |
| 2.3.5.4 重组载体pPICZαC-ysadh的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.5.5 酵母感受态的制备 | 第40页 |
| 2.3.5.6 重组载体pPICZαC-ysadh的电转化 | 第40-41页 |
| 2.3.5.7 重组菌X33/pPICZαC-ysadh甲醇诱导表达目的蛋白 | 第41页 |
| 2.4 结果与分析 | 第41-52页 |
| 2.4.1 YsADH重组蛋白的诱导表达 | 第41-43页 |
| 2.4.2 YsADH重组酶的酶学性质 | 第43-51页 |
| 2.4.2.1 底物特异性 | 第43-45页 |
| 2.4.2.2 最适温度及pH | 第45-47页 |
| 2.4.2.3 金属离子对YsADH的影响 | 第47页 |
| 2.4.2.4 热稳定性 | 第47-48页 |
| 2.4.2.5 有机溶剂对重组酶活力的影响 | 第48-50页 |
| 2.4.2.6 重组酶动力学参数测定 | 第50页 |
| 2.4.2.7 YsADH分子量测定 | 第50-51页 |
| 2.4.3 重组蛋白的可溶性表达优化 | 第51-52页 |
| 2.5 本章讨论与小结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 第三章 热稳定醇脱氢酶TgADH氧耐受性的分子改造 | 第56-77页 |
| 3.1 引言 | 第56-57页 |
| 3.2 实验材料 | 第57-58页 |
| 3.2.1 菌种 | 第57页 |
| 3.2.2 试剂 | 第57页 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 | 第57页 |
| 3.2.4 缓冲液 | 第57页 |
| 3.2.5 主要仪器 | 第57-58页 |
| 3.3 实验方法 | 第58-67页 |
| 3.3.1 菌体培养 | 第58页 |
| 3.3.2 E.coli BL21(DE3)/ pET30a-tgadh重组质粒的提取 | 第58-59页 |
| 3.3.3 定向进化改造TgADH的氧耐受性 | 第59-62页 |
| 3.3.3.1 突变基因文库的构建 | 第59页 |
| 3.3.3.2 突变子文库的构建 | 第59-61页 |
| 3.3.3.3 阳性突变子的高通量筛选 | 第61-62页 |
| 3.3.4 理性设计改造TgADH的氧敏感性 | 第62-66页 |
| 3.3.4.1 同源建模及分子对接 | 第62页 |
| 3.3.4.2 点饱和突变 | 第62-64页 |
| 3.3.4.3 酶切除去模板 | 第64页 |
| 3.3.4.4 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第64-65页 |
| 3.3.4.5 E.coliBL21(DE3)感受态细胞的转化及抗性筛选 | 第65页 |
| 3.3.4.6 正向突变TgADH序列测定 | 第65-66页 |
| 3.3.5 突变蛋白分析 | 第66-67页 |
| 3.3.5.1 纯酶的制备 | 第66页 |
| 3.3.5.2 重组酶酶活测定 | 第66页 |
| 3.3.5.3 最适温度、pH、动力学常数的测定 | 第66页 |
| 3.3.5.4 氧耐受性的检测 | 第66页 |
| 3.3.5.5 圆二色谱(CD) | 第66-67页 |
| 3.4 结果与分析 | 第67-75页 |
| 3.4.1 定向进化 | 第67-69页 |
| 3.4.2 理性设计 | 第69-70页 |
| 3.4.3 突变子酶学性质的表征 | 第70-75页 |
| 3.4.3.1 蛋白质纯化 | 第70-71页 |
| 3.4.3.2 突变子的最适温度 | 第71-72页 |
| 3.4.3.3 突变子的最适pH | 第72页 |
| 3.4.3.4 氧耐受性的考察 | 第72-73页 |
| 3.4.3.5 圆二色谱 | 第73-75页 |
| 3.5 本章小结 | 第75页 |
| 参考文献 | 第75-77页 |
| 第四章 理性设计改造TgADH的辅酶倾向性 | 第77-94页 |
| 4.1 引言 | 第77-78页 |
| 4.2 实验材料 | 第78-79页 |
| 4.2.1 菌种及质粒载体 | 第78页 |
| 4.2.2 培养试剂及培养 | 第78页 |
| 4.2.3 缓冲液 | 第78页 |
| 4.2.4 试剂 | 第78页 |
| 4.2.5 主要仪器 | 第78-79页 |
| 4.3 实验方法 | 第79-84页 |
| 4.3.1 菌种活化培养及质粒的提取 | 第79页 |
| 4.3.2 TgADH同源建模及引物设计 | 第79-80页 |
| 4.3.3 质粒的PCR扩增 | 第80-81页 |
| 4.3.4 突变子的构建及筛选 | 第81-83页 |
| 4.3.5 纯酶的制备 | 第83页 |
| 4.3.6 突变子酶学性质的表征 | 第83页 |
| 4.3.6.1 最适温度 | 第83页 |
| 4.3.6.2 最适pH | 第83页 |
| 4.3.6.3 重组酶动力学常数测定 | 第83页 |
| 4.3.7 重组酶的活力测定 | 第83-84页 |
| 4.4 结果与分析 | 第84-92页 |
| 4.4.1 重组质粒的定点突变PCR扩增 | 第84页 |
| 4.4.2 重组蛋白的纯化 | 第84-85页 |
| 4.4.3. 双点饱和突变结果 | 第85-86页 |
| 4.4.4 突变子酶学性质的表征 | 第86-89页 |
| 4.4.4.1 突变蛋白活力检测 | 第86页 |
| 4.4.4.2 最适温度 | 第86-87页 |
| 4.4.4.3 最适pH | 第87-88页 |
| 4.4.4.4 动力学常数 | 第88-89页 |
| 4.4.5 TgADH的序列结构比对 | 第89-90页 |
| 4.4.6 TgADH的同源建模及分子对接 | 第90-92页 |
| 4.5 本章小结 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-94页 |
| 第五章 结论与展望 | 第94-97页 |
| 5.1 结论 | 第94-95页 |
| 5.2 展望 | 第95-97页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98页 |
