| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 1 前言 | 第14-40页 |
| 1.1 古菌概述 | 第14-16页 |
| 1.1.1 古菌简介 | 第14页 |
| 1.1.2 古菌的多样性与分类 | 第14-15页 |
| 1.1.3 硫化叶菌 | 第15-16页 |
| 1.2 硫化叶菌的遗传体系 | 第16-20页 |
| 1.2.1 硫化叶菌的转化 | 第16-17页 |
| 1.2.2 选择标记 | 第17-18页 |
| 1.2.3 基因敲除体系 | 第18-20页 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统概述 | 第20-24页 |
| 1.3.1 CRISPR-Cas的发现 | 第21页 |
| 1.3.2 CRISPR-Cas的结构和功能 | 第21-23页 |
| 1.3.3 CRISPR-Cas的多样性与分类 | 第23-24页 |
| 1.4 CRISPR-Cas的机制研究 | 第24-36页 |
| 1.4.1 spacer的获取 | 第25-28页 |
| 1.4.2 crRNA的加工 | 第28-30页 |
| 1.4.3 target的干涉 | 第30-36页 |
| 1.5 CRISPR-Cas的应用与发展 | 第36-38页 |
| 1.6 硫化叶菌的CRISPR-Cas系统 | 第38-39页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第39-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-53页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第40-43页 |
| 2.2 培养基配方及培养条件 | 第43-45页 |
| 2.3 主要分子生物学试剂 | 第45页 |
| 2.4 主要实验仪器 | 第45-46页 |
| 2.5 实验方法 | 第46-53页 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α 感受态制备和热激转化法 | 第46页 |
| 2.5.2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法 | 第46-48页 |
| 2.5.3 人工mini-CRISPR质粒和干涉质粒的构建 | 第48页 |
| 2.5.4 基因编辑质粒和纯化Cmr复合物的表达质粒的构建 | 第48-49页 |
| 2.5.5 提取硫化叶菌总DNA | 第49页 |
| 2.5.6 β-galactosidase(LacS)酶活分析 | 第49-50页 |
| 2.5.7 Cmr-2α-His的共纯化 | 第50页 |
| 2.5.8 SDS-PAGE和Western Blot | 第50-51页 |
| 2.5.9 天然Cmr-α 复合物的纯化 | 第51页 |
| 2.5.10 crRNA的提取和标记 | 第51-52页 |
| 2.5.11 Cmr-α 复合物的RNA切割与结合活性分析 | 第52页 |
| 2.5.12 Cmr-α 复合物的ssDNA切割活性分析 | 第52-53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-87页 |
| 3.1 基于內源CRISPR系统基因组编辑方法的建立 | 第53-63页 |
| 3.1.1 基于內源CRISPR系统基因组编辑方法的原理 | 第53-54页 |
| 3.1.2 利用内源CRISPR系统精准编辑lacS基因 | 第54-58页 |
| 3.1.3 利用Ⅲ-B型CRISPR系统在基因组上插入特定序列 | 第58-61页 |
| 3.1.4 利用I-A型CRISPR系统在基因组上构建点突变 | 第61-63页 |
| 3.2 冰岛硫化叶菌Cmr-α 系统天然RNP复合物及crRNA的特征 | 第63-66页 |
| 3.2.1 Cmr-α 系统天然RNP复合物的纯化 | 第63-64页 |
| 3.2.2 Cmr-α 天然RNP复合物中crRNA的提取 | 第64-66页 |
| 3.3 冰岛硫化叶菌Cmr-α 复合物RNA和DNA切割活性 | 第66-74页 |
| 3.3.1 Cmr-α 复合物的RNA切割活性 | 第66-70页 |
| 3.3.2 Cmr-α 复合物的ssDNA切割活性 | 第70-73页 |
| 3.3.3 Cmr2α 的HD和Palm两个结构域共同负责DNA干涉 | 第73-74页 |
| 3.4 冰岛硫化叶菌Cmr-α 系统复合物组装及crRNA的加工模式 | 第74-77页 |
| 3.4.1 不同长度的spacer生成固定长度的crRNA | 第74-76页 |
| 3.4.2 Cmr-α 系统中CRISPR簇只需要一个repeat | 第76-77页 |
| 3.5 冰岛硫化叶菌Cmr-α 系统识别target RNA的机制 | 第77-87页 |
| 3.5.1 crRNA的 3’端序列对Cmr-α 复合物核酸切割活性的影响 | 第77-79页 |
| 3.5.2 Cmr1α 缺失株的RNA和DNA干涉活性 | 第79-82页 |
| 3.5.3 Cmr1α 的结构分析 | 第82-84页 |
| 3.5.4 Cmr1α 介导Cmr-α 复合物捕获target RNA | 第84-87页 |
| 4 讨论与展望 | 第87-94页 |
| 4.1 基于内源CRISPR系统的基因组编辑技术 | 第87-88页 |
| 4.2 Ⅲ型CRISPR-Cas系统的核酸干涉机制及生物学意义 | 第88-90页 |
| 4.3 冰岛硫化叶菌Cmr-α 系统crRNA的加工模式 | 第90-91页 |
| 4.4 冰岛硫化叶菌Cmr-α 复合物捕获靶标RNA的模型 | 第91-94页 |
| 参考文献 | 第94-108页 |
| 附录 | 第108-113页 |
| 附录A.本研究所用引物 | 第108-112页 |
| 附录B.本研究所用核酸底物 | 第112-113页 |
| 博士期间学术成果 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
