| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-23页 |
| 1.1 人绒毛膜促性腺激素 | 第10-12页 |
| 1.1.1 人绒毛膜促性腺激素的简介 | 第10-11页 |
| 1.1.2 人绒毛膜促性腺激素的临床作用 | 第11页 |
| 1.1.3 人绒毛膜促性腺激素的生产方法简介 | 第11-12页 |
| 1.2 哺乳动物细胞表达系统生产重组蛋白药物 | 第12-14页 |
| 1.2.1 国内外重组蛋白药物的发展进程 | 第12页 |
| 1.2.2 中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统 | 第12-14页 |
| 1.3 定点整合系统筛选稳定表达细胞株 | 第14-17页 |
| 1.3.1 FLP-In定点整合系统的简介 | 第14-17页 |
| 1.3.2 FLP-In定点整合系统的优点 | 第17页 |
| 1.4 实时荧光定量PCR | 第17-19页 |
| 1.4.1 实时荧光定量PCR的简介 | 第17-18页 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR的相对定量 | 第18-19页 |
| 1.4.3 实时荧光定量PCR的绝对定量 | 第19页 |
| 1.4.4 实时荧光定量PCR技术的应用 | 第19页 |
| 1.5 外源基因在哺乳动物细胞表达过程中限制因素的研究 | 第19-21页 |
| 1.5.1 载体设计、质粒整合和染色体环境 | 第20页 |
| 1.5.2 mRNA的稳定性和加工处理 | 第20-21页 |
| 1.5.3 蛋白质的翻译和分泌 | 第21页 |
| 1.6 研究内容与研究意义 | 第21-23页 |
| 第2章 人绒毛膜促性腺激素表达载体的构建 | 第23-40页 |
| 2.1 前言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第23页 |
| 2.2.2 培养基和溶液 | 第23-24页 |
| 2.2.3 主要试剂、试剂盒、仪器设备及分析软件 | 第24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-31页 |
| 2.3.1 菌种培养和保藏 | 第24页 |
| 2.3.2 质粒抽提步骤 | 第24-25页 |
| 2.3.3 琼脂糖凝胶回收步骤 | 第25页 |
| 2.3.4 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备步骤 | 第25-26页 |
| 2.3.5 DH5α感受态细胞的转化 | 第26页 |
| 2.3.6 包含两个PCMV-BGHpA表达框的pcDNA5/FRT载体构建 | 第26-28页 |
| 2.3.7 含有α亚基的pcDNA5/FRT(2)-α载体的构建 | 第28-30页 |
| 2.3.8 含有α亚基和β亚基的pcDNA5/FRT-hCGαβ载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.4 实验结果 | 第31-39页 |
| 2.4.1 包含两个PCMV-BGHpA表达框的pcDNA5/FRT载体构建 | 第31-35页 |
| 2.4.2 含有α亚基的pcDNA5/FRT(2)-α载体构建 | 第35-37页 |
| 2.4.3 含有β亚基的pcDNA5/FRT-hCGαβ载体构建 | 第37-39页 |
| 2.5 小结 | 第39-40页 |
| 第3章 FLP-In定点整合系统和流式细胞仪细胞分选技术的建立 | 第40-47页 |
| 3.1 前言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40-42页 |
| 3.2.1 细胞株、质粒 | 第40-41页 |
| 3.2.2 培养基和溶液 | 第41页 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 | 第41-42页 |
| 3.3 实验方法 | 第42-43页 |
| 3.3.1 细胞培养 | 第42页 |
| 3.3.2 质粒转染 | 第42页 |
| 3.3.3 流式细胞仪检测细胞的转染效率 | 第42页 |
| 3.3.4 FLP-In定点整合系统宿主细胞株的筛选 | 第42-43页 |
| 3.3.5 FLP-In定点整合系统表达细胞株的筛选 | 第43页 |
| 3.4 实验结果 | 第43-45页 |
| 3.4.1 FLP-In定点整合系统宿主细胞系筛选转染效率的测定 | 第43-44页 |
| 3.4.2 流式细胞仪分选细胞 | 第44-45页 |
| 3.5 小结 | 第45-47页 |
| 第4章 CHO细胞表达rhCG蛋白的表达调控机理研究 | 第47-59页 |
| 4.1 前言 | 第47页 |
| 4.2 实验材料 | 第47-48页 |
| 4.2.1 细胞株、培养基 | 第47页 |
| 4.2.2 实验试剂和仪器 | 第47-48页 |
| 4.3 实验方法 | 第48-52页 |
| 4.3.1 总RNA抽提和hCG mRNA的测定 | 第48-49页 |
| 4.3.2 hCG各亚基mRNA稳定性分析 | 第49页 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR绝对定量标准品的制备 | 第49-50页 |
| 4.3.4 转录速率分析 | 第50-51页 |
| 4.3.5 ELISA方法检测hCG各亚基和完整hCG蛋白的浓度 | 第51-52页 |
| 4.4 实验结果 | 第52-57页 |
| 4.4.1 不同表达水平细胞株各亚基mRNA水平的比较 | 第52-53页 |
| 4.4.2 不同表达水平细胞株各亚基mRNA稳定性的比较 | 第53-54页 |
| 4.4.3 不同表达水平细胞株转录速率的比较 | 第54-55页 |
| 4.4.4 不同表达水平细胞株胞内胞外α亚基多肽和β亚基多肽水平的比较 | 第55-56页 |
| 4.4.5 不同表达水平细胞株胞内胞外完整rhCG蛋白浓度的比较 | 第56-57页 |
| 4.5 小结 | 第57-59页 |
| 第5章 总结与展望 | 第59-61页 |
| 5.1 总结 | 第59页 |
| 5.2 主要创新点 | 第59-60页 |
| 5.3 展望 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
