| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 一、前言 | 第9-18页 |
| 1. 植物原生质体 | 第9-11页 |
| 1.1 植物原生质体的游离 | 第9页 |
| 1.2 原生质体遗传转化 | 第9-10页 |
| 1.3 原生质体瞬时遗传转化的应用 | 第10-11页 |
| 2. RNA干扰 | 第11-14页 |
| 2.1 RNA干扰技术的发展 | 第11-12页 |
| 2.2 RNAi的作用机制 | 第12-13页 |
| 2.3 RNAi的特征 | 第13-14页 |
| 2.4 RNAi在植物中的应用 | 第14页 |
| 3. 硫苷的合成途径及其在番木瓜中的研究 | 第14-17页 |
| 4 本研究目的和意义 | 第17-18页 |
| 二 材料与方法 | 第18-35页 |
| 1 材料 | 第18-25页 |
| 1.1 植物材料 | 第18页 |
| 1.2 菌株 | 第18页 |
| 1.3 载体及其图谱 | 第18-21页 |
| 1.4 仪器 | 第21页 |
| 1.5 主要试剂 | 第21-22页 |
| 1.6 原生质体分离主要试剂 | 第22页 |
| 1.7 引物 | 第22-25页 |
| 2 方法 | 第25-35页 |
| 2.1 番木瓜叶片原生质体RNAi遗传转化平台的建立 | 第25-34页 |
| 2.1.1 外源基因的沉默 | 第25-32页 |
| 2.1.1.1 原生质体的分离 | 第25页 |
| 2.1.1.2 原生质体产量与活力检测 | 第25-26页 |
| 2.1.1.3 pRNAi-GFP载体的构建 | 第26-29页 |
| 2.1.1.3.1 pRNAi-GFP的PCR产物1的扩增 | 第26页 |
| 2.1.1.3.2 PCR产物回收 | 第26-27页 |
| 2.1.1.3.3 pRNAi-GFP的PCR产物2的扩增 | 第27-28页 |
| 2.1.1.3.4 T4-DNA聚合酶处理PCR产物 | 第28页 |
| 2.1.1.3.5 pRNAi-LIC的处理 | 第28页 |
| 2.1.1.3.6 混合连接 | 第28页 |
| 2.1.1.3.7 转化 | 第28-29页 |
| 2.1.1.3.8 鉴定 | 第29页 |
| 2.1.1.4 PEG介导的叶片原生质体的转化 | 第29-30页 |
| 2.1.1.5 RT-PCR检测沉默效率 | 第30-32页 |
| 2.1.1.5.1 总RNA的提取 | 第30页 |
| 2.1.1.5.2 cDNA的合成 | 第30-31页 |
| 2.1.1.5.3 以反转录合成的cDNA第一链为模板的RT-PCR | 第31-32页 |
| 2.1.2 内源基因的沉默 | 第32-34页 |
| 2.1.2.1 CYP79A2.1等六个BG合成途径中候选基因的克隆 | 第32-34页 |
| 2.1.2.1.1 目的基因的扩增 | 第32页 |
| 2.1.2.1.2 CYP79A2.1等PCR产物与T载体连接 | 第32页 |
| 2.1.2.1.3 重组质粒转化感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.1.2.1.4 序列测定和生物信息学分析 | 第33页 |
| 2.1.2.1.5 CYP79A2.1等质粒的提取 | 第33-34页 |
| 2.1.2.2 CYP79A2.1等基因RNAi载体的构建及原生质体的转化 | 第34页 |
| 2.1.2.2.1 靶标序列的选择和设计 | 第34页 |
| 2.1.2.2.2 RNAi载体的构建及原生质体转化 | 第34页 |
| 2.1.2.3 RT-PCR对CYP79A2.1等六个候选基因表达的检测 | 第34页 |
| 2.2 RNAi遗传转化平台的应用 | 第34-35页 |
| 2.2.1 转化后原生质体中BG含量的测定 | 第34-35页 |
| 2.2.1.1 标准品和供试品溶液的制备 | 第34页 |
| 2.2.1.2 色谱条件 | 第34-35页 |
| 2.2.1.3 线性关系考察 | 第35页 |
| 三 结果与分析 | 第35-52页 |
| 0. 番木瓜叶片原生质体制备结果 | 第35-36页 |
| 2. pRNAi-GFP载体的克隆与鉴定 | 第36-37页 |
| 3. PEG介导的原生质体遗传转化技术的优化 | 第37页 |
| 4. pRNAi-GFP载体浓度与沉默的关系 | 第37-38页 |
| 5. pRNAi-GFP的沉默时间与沉默效率的关系 | 第38-39页 |
| 6. pHBT-GFP植物表达载体与pRNAi-GFP的原生质体转化结果 | 第39页 |
| 7. RT-PCR检测pRNAi-GFP载体的沉默效率 | 第39-40页 |
| 8. CP-CYP79A2.1等BG合成途径中六个候选基因的克隆结果 | 第40页 |
| 9. siRNA的预测和靶标序列的设计 | 第40-46页 |
| 10. pRNAi-P1A等RNAi载体的构建与鉴定 | 第46-48页 |
| 11. RT-PCR检测pRNAi-P1A等载体的沉默效率 | 第48-50页 |
| 12. BG含量检测 | 第50-52页 |
| 四 讨论 | 第52-55页 |
| 1. 原生质体RNAi平台的建立 | 第52-54页 |
| 2. RNAi沉默平台的应用 | 第54-55页 |
| 五 结论 | 第55-57页 |
| 参考文献 | 第57-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
