| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略语 | 第9-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-23页 |
| 1.糖尿病概况及危害 | 第14页 |
| 2. 鲨肝活性肽的研究进展 | 第14-16页 |
| 3. TBC家族的研究进展 | 第16-18页 |
| 3.1 TBC蛋白家族 | 第16-17页 |
| 3.2 TBC1D15 的研究进展 | 第17-18页 |
| 4. microRNA的研究和生物信息学分析 | 第18-19页 |
| 4.1 microRNA的研究 | 第18-19页 |
| 4.2 microRNA的调控作用 | 第19页 |
| 5. 实验方案设计 | 第19-23页 |
| 5.1 实验的目的与意义 | 第19-20页 |
| 5.2 研究的内容 | 第20-22页 |
| 5.3 实验流程图 | 第22-23页 |
| 第二章 APSL全蛋白对Rab7 的体外GAP活性分析 | 第23-33页 |
| 1. 材料与试剂 | 第23-26页 |
| 1.1 材料 | 第23页 |
| 1.2 试剂 | 第23-26页 |
| 2. 方法 | 第26-28页 |
| 2.1. CaCl2法制备E. coli BL21 感受态细胞 | 第26页 |
| 2.2 质粒转化 | 第26-27页 |
| 2.3 APSL全蛋白原核表达纯化 | 第27页 |
| 2.4 融合蛋白MBP-Rab7-WT/Q67L/T22N基因的原核表达及产物纯化 | 第27页 |
| 2.5 His-pull down | 第27-28页 |
| 3. 实验结果 | 第28-32页 |
| 3.1 APSL全蛋白表达纯化 | 第28-29页 |
| 3.2 融合蛋白MBP-Rab7-WT/Q67L/T22N表达纯化 | 第29-30页 |
| 3.3 APSL全蛋白对Rab7 的体外GAP活性分析（His pull down） | 第30-32页 |
| 4. 讨论 | 第32-33页 |
| 第三章 APSL全蛋白体外GAP活性特异性分析 | 第33-40页 |
| 1 材料与试剂 | 第33页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第33页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第33页 |
| 1.3 Rab4/Rab5/Rab8/Rab11 基因的获得 | 第33页 |
| 2 方法 | 第33-35页 |
| 2.1 目的基因和载体质粒双酶切 | 第33-34页 |
| 2.2 目的基因和载体质粒连接反应 | 第34页 |
| 2.3 CaCl2法制备E. coli TG1 感受态细胞 | 第34页 |
| 2.4 连接产物转化 | 第34页 |
| 2.5 重组质粒的提取及鉴定 | 第34页 |
| 2.6 融合蛋白His-sumo-Rab4/Rab5/Rab7-WT/Rab8/Rab11 表达纯化 | 第34-35页 |
| 2.7 Bradford法测蛋白浓度 | 第35页 |
| 2.8 APSL全蛋白与多种Rab蛋白体外GAP活性特异性分析 | 第35页 |
| 3 实验结果 | 第35-39页 |
| 3.1 重组质粒pETduet-His-sumo-Rab4/Rab5/Rab7/Rab8/Rab11 菌液PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.2 融合蛋白His-sumo-Rab4/Rab5/Rab7/Rab8/Rab11 表达纯化 | 第36-37页 |
| 3.3 APSL全蛋白的Rab-GAP特异性分析 | 第37-39页 |
| 4 讨论 | 第39-40页 |
| 第四章 靶定shark TBC1D153’UTR的microRNA筛选及鉴定 | 第40-48页 |
| 1 材料与试剂 | 第40页 |
| 2 方法 | 第40-42页 |
| 2.1 shark TBC1D153’UTR的获得 | 第40页 |
| 2.2 靶定miRNA的筛选 | 第40页 |
| 2.3 截取 200 bp的 3’UTR序列送到公司合成 | 第40-41页 |
| 2.4 双酶切及连接反应 | 第41页 |
| 2.5 连接产物的转化及重组质粒鉴定 | 第41页 |
| 2.6 筛选能靶定到截断UTR的miRNA并合成minics | 第41页 |
| 2.7 细胞冻存 | 第41页 |
| 2.8 细胞复苏 | 第41-42页 |
| 2.9 质粒的提取 | 第42页 |
| 2.10 细胞转染 | 第42页 |
| 2.11 双荧光素酶报告基因的检测 | 第42页 |
| 3. 实验结果 | 第42-47页 |
| 3.1 筛选靶定到shark TBC1D153’UTR的miRNA | 第42-44页 |
| 3.2 pUC57-3’UTR载体双酶切 | 第44页 |
| 3.3 3’UTR重组质粒的鉴定 | 第44-45页 |
| 3.4 筛选出靶定 200 bp UTR的miRNA及合成minics | 第45-46页 |
| 3.5 双荧光素酶报告法验证靶基因 3’UTR的microRNA | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 第五章 融合蛋白shark TBC1D15 制备多克隆抗体 | 第48-54页 |
| 1 材料与试剂 | 第48-49页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第48页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第48-49页 |
| 2 方法 | 第49-50页 |
| 2.1 抗原的制备 | 第49页 |
| 2.2 免疫动物及多抗的制备 | 第49页 |
| 2.3 血清多抗效价的测定 | 第49-50页 |
| 2.4 Western Blotting检测 | 第50页 |
| 3 实验结果 | 第50-52页 |
| 3.1 血清多抗效价检测 | 第50-51页 |
| 3.2 血清多抗Western Blotting检测 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 小结 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-60页 |
| 致谢 | 第60页 |
