| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 前言 | 第11-17页 |
| 1 莲腐败病的研究进展 | 第11-12页 |
| 1.1 莲腐败病的发生规律和危害情况 | 第11页 |
| 1.2 莲腐败病的防治 | 第11-12页 |
| 1.2.1 生物防治 | 第11页 |
| 1.2.2 化学防治 | 第11-12页 |
| 1.2.3 轮作 | 第12页 |
| 1.2.4 抗病品种的选育 | 第12页 |
| 1.2.5 冬季莲田浸水 | 第12页 |
| 2 多聚半乳糖醛酸酶的研究进展 | 第12-14页 |
| 2.1 多聚半乳糖醛酸酶的类型 | 第12-13页 |
| 2.2 多聚半乳糖醛酸酶基因及其序列特征 | 第13-14页 |
| 2.3 真菌多聚半乳糖醛酸酶的致病性 | 第14页 |
| 3 亚细胞定位的研究概况 | 第14-15页 |
| 4 本研究的目的及内容 | 第15-16页 |
| 4.1 研究目的 | 第15页 |
| 4.2 研究内容 | 第15-16页 |
| 5 技术路线图 | 第16-17页 |
| 第二章 莲腐败病菌三个PG同工酶的真核表达 | 第17-35页 |
| 1 引言 | 第17页 |
| 2 材料和方法 | 第17-18页 |
| 2.1 供试真菌菌株和植物 | 第17页 |
| 2.2 载体及菌株 | 第17页 |
| 2.3 主要试剂 | 第17-18页 |
| 2.4 主要仪器 | 第18页 |
| 3 实验方法 | 第18-27页 |
| 3.1 引物设计 | 第18页 |
| 3.2 真核表达构建路线 | 第18-19页 |
| 3.3 pg1、pg5、pgb基因TA克隆 | 第19-20页 |
| 3.3.1 PG基因全长序列的扩增 | 第19页 |
| 3.3.2 PCR产物回收纯化 | 第19页 |
| 3.3.3 连接产物的转化 | 第19-20页 |
| 3.3.4 PCR法鉴定重组子 | 第20页 |
| 3.4 真核表达载体的构建 | 第20-22页 |
| 3.4.1 质粒的提取 | 第20-21页 |
| 3.4.2 TA克隆质粒和载体质粒的双酶切 | 第21页 |
| 3.4.3 酶切产物的纯化回收 | 第21页 |
| 3.4.4 酶切产物的连接 | 第21页 |
| 3.4.5 连接产物的转化 | 第21-22页 |
| 3.4.6 单菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第22页 |
| 3.5 PG同工酶重组质粒的真核表达 | 第22-23页 |
| 3.5.1 感受态酵母的制备 | 第22页 |
| 3.5.2 单酶切线性化重组表达质粒的制备 | 第22页 |
| 3.5.3 回收纯化单酶切产物 | 第22页 |
| 3.5.4 电转化感受态Pichia pastoris SMD1168 | 第22-23页 |
| 3.5.5 转化子PCR鉴定 | 第23页 |
| 3.5.6 转化子的诱导表达 | 第23页 |
| 3.6 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第23-24页 |
| 3.6.1 制胶 | 第23页 |
| 3.6.2 样品制备 | 第23页 |
| 3.6.3 上样 | 第23页 |
| 3.6.4 电泳 | 第23页 |
| 3.6.5 染色、脱色 | 第23-24页 |
| 3.6.6 检测 | 第24页 |
| 3.7 重组蛋白的Western blot | 第24页 |
| 3.7.1 SDS-PAGE电泳 | 第24页 |
| 3.7.2 转膜 | 第24页 |
| 3.7.3 染色 | 第24页 |
| 3.7.4 封闭 | 第24页 |
| 3.7.5 抗体孵育 | 第24页 |
| 3.7.6 清洗 | 第24页 |
| 3.7.7 发光液显色 | 第24页 |
| 3.7.8 检测 | 第24页 |
| 3.7.9 保存 | 第24页 |
| 3.8 PG同工酶重组蛋白浓度测定（Bradford法） | 第24-25页 |
| 3.9 PG同工酶重组蛋白致病性测定 | 第25页 |
| 3.10 PG同工酶重组蛋白的部分酶学特性分析 | 第25-26页 |
| 3.10.1 最适温度的测定 | 第25页 |
| 3.10.2 最适温度稳定性测定 | 第25页 |
| 3.10.3 最适pH的测定 | 第25页 |
| 3.10.4 最适pH稳定性测定 | 第25-26页 |
| 3.11 石蜡切片制作 | 第26-27页 |
| 3.11.1 选材 | 第26页 |
| 3.11.2 杀死、固定 | 第26页 |
| 3.11.3 脱水与透明 | 第26页 |
| 3.11.4 浸蜡 | 第26页 |
| 3.11.5 包埋 | 第26页 |
| 3.11.6 修蜡块 | 第26页 |
| 3.11.7 切片 | 第26页 |
| 3.11.8 展片和粘片 | 第26页 |
| 3.11.9 脱蜡与复水 | 第26页 |
| 3.11.10 染色、透明与封片 | 第26-27页 |
| 4 结果分析 | 第27-33页 |
| 4.1 pg1、pg5和pgb基因的TA克隆 | 第27页 |
| 4.2 双酶切 | 第27页 |
| 4.3 真核表达载体pPICZαA-pg1、pPICZαA-pg5和pPICZαA-pgb构建 | 第27-28页 |
| 4.4 pg1、pg5和pgb三个基因的真核表达 | 第28-29页 |
| 4.5 转化子的诱导表达 | 第29页 |
| 4.6 PG1、PG5和PGb同工酶重组蛋白致病性测定 | 第29-31页 |
| 4.7 重组蛋白的部分酶学特性分析 | 第31-33页 |
| 4.8 细胞水平观察 | 第33页 |
| 5 结论与讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 莲腐败病菌三个PG基因产物的亚细胞定位分析 | 第35-42页 |
| 1 引言 | 第35页 |
| 2 材料和方法 | 第35-38页 |
| 2.1 植物材料 | 第35页 |
| 2.2 菌株和载体 | 第35页 |
| 2.3 试剂和溶液 | 第35页 |
| 2.4 Gateway载体的构建 | 第35-37页 |
| 2.4.1 PCR扩增目的基因 | 第35-36页 |
| 2.4.2 BP反应 | 第36-37页 |
| 2.4.3 LR反应 | 第37页 |
| 2.5 农杆菌转化 | 第37-38页 |
| 2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 2.5.2 土壤农杆菌转化 | 第37-38页 |
| 2.5.3 转化质粒的培养 | 第38页 |
| 2.6 亚细胞定位 | 第38页 |
| 2.7 信号肽位点分析 | 第38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-41页 |
| 3.1 信号肽位点分析 | 第38-40页 |
| 3.2 PG1、PG5和PGb在寄主细胞中的亚细胞定位 | 第40-41页 |
| 4 结论与讨论 | 第41-42页 |
| 第四章 莲腐败病菌PG同工酶的功能验证 | 第42-52页 |
| 1 引言 | 第42页 |
| 2 材料和方法 | 第42-47页 |
| 2.1 供试菌株及载体 | 第42-43页 |
| 2.2 主要试剂 | 第43页 |
| 2.3 引物设计 | 第43-44页 |
| 2.4 基因敲除载体的构建 | 第44-46页 |
| 2.4.1 扩增PG基因上下游片段 | 第44-45页 |
| 2.4.2 目的片段回收纯化 | 第45页 |
| 2.4.3 单酶切 | 第45页 |
| 2.4.4 连接DNA片段 | 第45页 |
| 2.4.5 反应产物转化、涂板 | 第45页 |
| 2.4.6 克隆鉴定阳性重组子 | 第45-46页 |
| 2.5 镰刀菌转化 | 第46-47页 |
| 2.5.1 镰刀菌F23a孢子的培养 | 第46页 |
| 2.5.2 土壤根瘤农杆菌感受态的制备 | 第46页 |
| 2.5.3 土壤农杆菌转化 | 第46页 |
| 2.5.4 镰刀菌ATMT | 第46-47页 |
| 2.5.5 PCR检测敲除转化镰刀菌 | 第47页 |
| 2.5.6 突变体菌株的培养 | 第47页 |
| 2.5.7 PG同工酶基因敲除突变体致病性测定 | 第47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-50页 |
| 3.1 PG同工酶基因敲除载体的构建 | 第47-48页 |
| 3.2 镰刀菌ATMT | 第48页 |
| 3.3 野生型F23a与敲除突变体△F23a进行比较分析 | 第48-49页 |
| 3.4 突变体F23a致病性分析 | 第49-50页 |
| 4 结论与讨论 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-56页 |
| 附录 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
