中文摘要 | 第13-15页 |
Abstract | 第15-16页 |
1 前言 | 第17-35页 |
1.1 SUMO结构及SUMO化过程 | 第17-22页 |
1.1.1 翻译后修饰 | 第17-18页 |
1.1.2 SUMO蛋白的发现 | 第18页 |
1.1.3 SUMO蛋白结构 | 第18页 |
1.1.4 SUMO化过程 | 第18-20页 |
1.1.5 参与SUMO化过程的酶 | 第20-22页 |
1.1.5.1 类泛素蛋白加工酶 | 第20页 |
1.1.5.2 SUMO激活酶(E1) | 第20页 |
1.1.5.3 SUMO结合酶(E2) | 第20页 |
1.1.5.4 SUMO E3连接酶 | 第20-21页 |
1.1.5.5 SUMO E4连接酶 | 第21页 |
1.1.5.6 SUMO泛素E3连接酶(STUbL) | 第21-22页 |
1.2 植物体内SUMO化功能 | 第22-26页 |
1.2.1 SUMO化在植物逆境胁迫下的功能 | 第22-24页 |
1.2.1.1 高温胁迫 | 第22页 |
1.2.1.2 低温胁迫 | 第22-23页 |
1.2.1.3 干旱胁迫 | 第23页 |
1.2.1.4 盐胁迫 | 第23-24页 |
1.2.2 SUMO化在营养代谢方面的功能 | 第24-25页 |
1.2.2.1 磷元素胁迫 | 第24页 |
1.2.2.2 氮元素吸收 | 第24页 |
1.2.2.3 铜离子胁迫 | 第24-25页 |
1.2.3 SUMO化在植物生长发育中的作用 | 第25页 |
1.2.4 SUMO化对信号途径的调节 | 第25页 |
1.2.5 SUMO化对植物花期的调节 | 第25-26页 |
1.2.6 SUMO化对植物抗病的调节 | 第26页 |
1.3 植物中的SUMO E3连接酶SIZ1 | 第26-27页 |
1.3.1 SIZ1的基本结构 | 第26页 |
1.3.2 SIZ1的基本功能 | 第26-27页 |
1.4 干旱、高温对植物的影响 | 第27-33页 |
1.4.1 干旱对植物的影响 | 第27-29页 |
1.4.1.1 活性氧的产生 | 第28页 |
1.4.1.2 活性氧的清除 | 第28-29页 |
1.4.1.3 植物的耐旱响应 | 第29页 |
1.4.2 高温对植物的影响 | 第29-30页 |
1.4.2.1 高温对植物体内ROS的影响 | 第30页 |
1.4.2.2 高温对生物膜的影响 | 第30页 |
1.4.3 植物的耐高温响应 | 第30-33页 |
1.4.3.1 HSPs在植物响应高温中的作用 | 第31-32页 |
1.4.3.2 HSFs在植物响应高温胁迫中的调节作用 | 第32-33页 |
1.4.3.3 HSFs与SUMO化间的关系 | 第33页 |
1.5 本研究的目的及其意义 | 第33-35页 |
2 材料与方法 | 第35-65页 |
2.1 实验材料 | 第35-39页 |
2.1.1 植物材料 | 第35页 |
2.1.2 材料的培养 | 第35页 |
2.1.3 菌株与载体 | 第35-36页 |
2.1.4 酶与各种生化试剂 | 第36页 |
2.1.5 所用抗体 | 第36-38页 |
2.1.6 培养基 | 第38-39页 |
2.2 实验方法 | 第39-65页 |
2.2.1 植物总RNA的提取 | 第39-40页 |
2.2.2 cDNA第一条链的合成 | 第40页 |
2.2.3 番茄SlSIZ1基因的克隆 | 第40-41页 |
2.2.4 目的片段的回收 | 第41-42页 |
2.2.5 目的片段与克隆载体的连接 | 第42-43页 |
2.2.5.1 Blunt载体平末端连接反应 | 第42页 |
2.2.5.2 TOPO连接反应 | 第42-43页 |
2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第43页 |
2.2.7 转化及克隆筛选 | 第43-44页 |
2.2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第44页 |
2.2.9 目的片段与表达载体的连接 | 第44-45页 |
2.2.9.1 T4酶连接法 | 第44-45页 |
2.2.9.2 LR反应 | 第45页 |
2.2.10 重组质粒的双酶切鉴定 | 第45页 |
2.2.11 农杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第45-46页 |
2.2.11.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
2.2.11.2 农杆菌转化 | 第46页 |
2.2.12 SlSIZ1的亚细胞定位 | 第46-47页 |
2.2.12.1 SlSIZ1-GFP表达载体的构建 | 第46页 |
2.2.12.2 烟草瞬时转化步骤 | 第46-47页 |
2.2.13 酵母双杂交 | 第47-49页 |
2.2.13.1 表达载体的构建 | 第47页 |
2.2.13.2 酵母感受态细胞(乙酸锂法)制备 | 第47-48页 |
2.2.13.3 酵母感受态细胞的转化 | 第48-49页 |
2.2.13.4 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)测定 | 第49页 |
2.2.14 实时定量荧光PCR | 第49-50页 |
2.2.15 SlSIZ1蛋白原核表达及Western杂交 | 第50-54页 |
2.2.15.1 原核表达载体的构建 | 第50页 |
2.2.15.2 大肠杆菌BL21原核表达 | 第50-51页 |
2.2.15.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第51-52页 |
2.2.15.4 Western杂交 | 第52-54页 |
2.2.16 体内SUMO化分析 | 第54-55页 |
2.2.16.1 表达载体的构建 | 第54-55页 |
2.2.16.2 瞬时转化本生烟草 | 第55页 |
2.2.16.3 SUMO化检测 | 第55页 |
2.2.17 双分子荧光互补(BiFC) | 第55-56页 |
2.2.17.1 构建双分子荧光互补载体及本生烟草转化 | 第55页 |
2.2.17.2 激光共聚焦扫描显微镜观察及处理 | 第55-56页 |
2.2.18 农杆菌介导的番茄转化 | 第56-58页 |
2.2.19 农杆菌介导的烟草转化 | 第58-59页 |
2.2.20 拟南芥的遗传转化 | 第59-60页 |
2.2.21 转基因植株的检测 | 第60-61页 |
2.2.21.1 CTAB微量法提取基因组DNA | 第60-61页 |
2.2.21.2 转基因植株的PCR检测 | 第61页 |
2.2.21.3 转基因植株的qRT-PCR检测 | 第61页 |
2.2.21.4 转基因植株的Western杂交 | 第61页 |
2.2.22 生理指标的测定 | 第61-64页 |
2.2.22.1 叶绿素含量的测定 | 第61页 |
2.2.22.2 植株生长量测定 | 第61页 |
2.2.22.3 叶片台盼蓝染色 | 第61页 |
2.2.22.4 电解质外渗量测定、膜脂过氧化程度测定 | 第61-62页 |
2.2.22.5 DAB和NBT染色分析及O_2~(·?)与H_2O_2含量的测定 | 第62页 |
2.2.22.6 APX、POD和CAT酶活性的测定 | 第62-64页 |
2.2.23 所用处理软件 | 第64-65页 |
3 结果与分析 | 第65-89页 |
3.1 不同胁迫下番茄体内的SUMO化分析 | 第65-66页 |
3.2 SlSIZ1基因的分离及特征 | 第66-68页 |
3.2.1 SlSIZ1基因全长序列的克隆 | 第66-67页 |
3.2.2 SlSIZ1核苷酸和氨基酸序列分析 | 第67-68页 |
3.3 SlSIZ1蛋白的亚细胞定位 | 第68-69页 |
3.4 SlSIZ1基因在大肠杆菌中的表达 | 第69页 |
3.5 SlSIZ1基因在番茄中的表达分析 | 第69-71页 |
3.5.1 SlSIZ1基因在番茄组织器官中的表达 | 第69-70页 |
3.5.2 SlSIZ1基因在其它逆境胁迫及信号物质下的表达分析 | 第70页 |
3.5.3 SlSIZ1基因在高温胁迫下的表达分析 | 第70-71页 |
3.6 SlSIZ1在拟南芥siz1-2 突变体中的转化 | 第71-72页 |
3.6.1 SlSIZ1基因正义表达载体的构建 | 第71-72页 |
3.6.2 转SlSIZ1拟南芥植株的鉴定 | 第72页 |
3.7 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体的表型 | 第72-75页 |
3.7.1 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体植株矮小的表型 | 第72-74页 |
3.7.2 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体对ABA敏感的表型 | 第74页 |
3.7.3 SlSIZ1部分恢复拟南芥siz1-2 突变体在逆境下的SUMO化程度 | 第74-75页 |
3.8 SlSIZ1具有SUMO E3连接酶功能 | 第75页 |
3.9 SlSIZ1基因在烟草中的遗传转化 | 第75-80页 |
3.9.1 过表达SlSIZ1基因烟草的获得 | 第75-76页 |
3.9.2 过表达SlSIZ1增加烟草的干旱抗性 | 第76-80页 |
3.9.2.1 干旱胁迫下幼苗的生长情况 | 第76-77页 |
3.9.2.2 干旱胁迫下成苗的生长情况 | 第77-78页 |
3.9.2.3 过表达SlSIZ1可以减少ROS的积累 | 第78-80页 |
3.9.2.4 过表达SlSIZ1可以促进烟草体内的SUMO化积累 | 第80页 |
3.10 SlSIZ1基因在番茄中的遗传转化 | 第80-89页 |
3.10.1 过表达SlSIZ1基因番茄的获得 | 第80-81页 |
3.10.2 过表达SlSIZ1增加番茄耐热性 | 第81-89页 |
3.10.2.1 高温胁迫下WT植株和转基因植株的生长状况 | 第81-82页 |
3.10.2.2 过表达SlSIZ1可以减少高温胁迫下番茄体内ROS的积累 | 第82-84页 |
3.10.2.3 高温相关基因表达情况 | 第84-85页 |
3.10.2.4 过表达SlSIZ1增加了番茄体内的SUMO化积累 | 第85页 |
3.10.2.5 过表达株系中有较高的Hsp70含量 | 第85-86页 |
3.10.2.6 SlHsfA1与SlSIZ1间存在互作 | 第86-87页 |
3.10.2.7 SlHsfA1可以被Sl SIZ1介导的SUMO化修饰 | 第87-89页 |
4 讨论 | 第89-96页 |
4.1 逆境会诱导番茄体内的SUMO化水平并且调节SlSIZ1基因的表达 | 第89-90页 |
4.2 SlSIZ1是番茄中的SUMO E3连接酶 | 第90-91页 |
4.3 过表达SlSIZ1提高了转基因烟草的干旱和转基因番茄的高温抗性 | 第91-92页 |
4.4 过表达SlSIZ1可以降低番茄在高温和干旱胁迫下ROS的积累 | 第92页 |
4.5 过表达株系中SUMO化水平提高有利于增加干旱和高温耐受能力 | 第92-93页 |
4.6 SlSIZ1增加番茄高温耐受能力的分子机制 | 第93-96页 |
5 结论 | 第96-97页 |
参考文献 | 第97-105页 |
致谢 | 第105-106页 |
攻读学位期间发表的论文 | 第106页 |