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番茄SUMO E3连接酶SlSIZ1的功能分析

中文摘要第13-15页
Abstract第15-16页
1 前言第17-35页
    1.1 SUMO结构及SUMO化过程第17-22页
        1.1.1 翻译后修饰第17-18页
        1.1.2 SUMO蛋白的发现第18页
        1.1.3 SUMO蛋白结构第18页
        1.1.4 SUMO化过程第18-20页
        1.1.5 参与SUMO化过程的酶第20-22页
            1.1.5.1 类泛素蛋白加工酶第20页
            1.1.5.2 SUMO激活酶(E1)第20页
            1.1.5.3 SUMO结合酶(E2)第20页
            1.1.5.4 SUMO E3连接酶第20-21页
            1.1.5.5 SUMO E4连接酶第21页
            1.1.5.6 SUMO泛素E3连接酶(STUbL)第21-22页
    1.2 植物体内SUMO化功能第22-26页
        1.2.1 SUMO化在植物逆境胁迫下的功能第22-24页
            1.2.1.1 高温胁迫第22页
            1.2.1.2 低温胁迫第22-23页
            1.2.1.3 干旱胁迫第23页
            1.2.1.4 盐胁迫第23-24页
        1.2.2 SUMO化在营养代谢方面的功能第24-25页
            1.2.2.1 磷元素胁迫第24页
            1.2.2.2 氮元素吸收第24页
            1.2.2.3 铜离子胁迫第24-25页
        1.2.3 SUMO化在植物生长发育中的作用第25页
        1.2.4 SUMO化对信号途径的调节第25页
        1.2.5 SUMO化对植物花期的调节第25-26页
        1.2.6 SUMO化对植物抗病的调节第26页
    1.3 植物中的SUMO E3连接酶SIZ1第26-27页
        1.3.1 SIZ1的基本结构第26页
        1.3.2 SIZ1的基本功能第26-27页
    1.4 干旱、高温对植物的影响第27-33页
        1.4.1 干旱对植物的影响第27-29页
            1.4.1.1 活性氧的产生第28页
            1.4.1.2 活性氧的清除第28-29页
            1.4.1.3 植物的耐旱响应第29页
        1.4.2 高温对植物的影响第29-30页
            1.4.2.1 高温对植物体内ROS的影响第30页
            1.4.2.2 高温对生物膜的影响第30页
        1.4.3 植物的耐高温响应第30-33页
            1.4.3.1 HSPs在植物响应高温中的作用第31-32页
            1.4.3.2 HSFs在植物响应高温胁迫中的调节作用第32-33页
            1.4.3.3 HSFs与SUMO化间的关系第33页
    1.5 本研究的目的及其意义第33-35页
2 材料与方法第35-65页
    2.1 实验材料第35-39页
        2.1.1 植物材料第35页
        2.1.2 材料的培养第35页
        2.1.3 菌株与载体第35-36页
        2.1.4 酶与各种生化试剂第36页
        2.1.5 所用抗体第36-38页
        2.1.6 培养基第38-39页
    2.2 实验方法第39-65页
        2.2.1 植物总RNA的提取第39-40页
        2.2.2 cDNA第一条链的合成第40页
        2.2.3 番茄SlSIZ1基因的克隆第40-41页
        2.2.4 目的片段的回收第41-42页
        2.2.5 目的片段与克隆载体的连接第42-43页
            2.2.5.1 Blunt载体平末端连接反应第42页
            2.2.5.2 TOPO连接反应第42-43页
        2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备第43页
        2.2.7 转化及克隆筛选第43-44页
        2.2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取第44页
        2.2.9 目的片段与表达载体的连接第44-45页
            2.2.9.1 T4酶连接法第44-45页
            2.2.9.2 LR反应第45页
        2.2.10 重组质粒的双酶切鉴定第45页
        2.2.11 农杆菌感受态细胞的制备及转化第45-46页
            2.2.11.1 农杆菌感受态细胞的制备第45-46页
            2.2.11.2 农杆菌转化第46页
        2.2.12 SlSIZ1的亚细胞定位第46-47页
            2.2.12.1 SlSIZ1-GFP表达载体的构建第46页
            2.2.12.2 烟草瞬时转化步骤第46-47页
        2.2.13 酵母双杂交第47-49页
            2.2.13.1 表达载体的构建第47页
            2.2.13.2 酵母感受态细胞(乙酸锂法)制备第47-48页
            2.2.13.3 酵母感受态细胞的转化第48-49页
            2.2.13.4 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)测定第49页
        2.2.14 实时定量荧光PCR第49-50页
        2.2.15 SlSIZ1蛋白原核表达及Western杂交第50-54页
            2.2.15.1 原核表达载体的构建第50页
            2.2.15.2 大肠杆菌BL21原核表达第50-51页
            2.2.15.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳第51-52页
            2.2.15.4 Western杂交第52-54页
        2.2.16 体内SUMO化分析第54-55页
            2.2.16.1 表达载体的构建第54-55页
            2.2.16.2 瞬时转化本生烟草第55页
            2.2.16.3 SUMO化检测第55页
        2.2.17 双分子荧光互补(BiFC)第55-56页
            2.2.17.1 构建双分子荧光互补载体及本生烟草转化第55页
            2.2.17.2 激光共聚焦扫描显微镜观察及处理第55-56页
        2.2.18 农杆菌介导的番茄转化第56-58页
        2.2.19 农杆菌介导的烟草转化第58-59页
        2.2.20 拟南芥的遗传转化第59-60页
        2.2.21 转基因植株的检测第60-61页
            2.2.21.1 CTAB微量法提取基因组DNA第60-61页
            2.2.21.2 转基因植株的PCR检测第61页
            2.2.21.3 转基因植株的qRT-PCR检测第61页
            2.2.21.4 转基因植株的Western杂交第61页
        2.2.22 生理指标的测定第61-64页
            2.2.22.1 叶绿素含量的测定第61页
            2.2.22.2 植株生长量测定第61页
            2.2.22.3 叶片台盼蓝染色第61页
            2.2.22.4 电解质外渗量测定、膜脂过氧化程度测定第61-62页
            2.2.22.5 DAB和NBT染色分析及O_2~(·?)与H_2O_2含量的测定第62页
            2.2.22.6 APX、POD和CAT酶活性的测定第62-64页
        2.2.23 所用处理软件第64-65页
3 结果与分析第65-89页
    3.1 不同胁迫下番茄体内的SUMO化分析第65-66页
    3.2 SlSIZ1基因的分离及特征第66-68页
        3.2.1 SlSIZ1基因全长序列的克隆第66-67页
        3.2.2 SlSIZ1核苷酸和氨基酸序列分析第67-68页
    3.3 SlSIZ1蛋白的亚细胞定位第68-69页
    3.4 SlSIZ1基因在大肠杆菌中的表达第69页
    3.5 SlSIZ1基因在番茄中的表达分析第69-71页
        3.5.1 SlSIZ1基因在番茄组织器官中的表达第69-70页
        3.5.2 SlSIZ1基因在其它逆境胁迫及信号物质下的表达分析第70页
        3.5.3 SlSIZ1基因在高温胁迫下的表达分析第70-71页
    3.6 SlSIZ1在拟南芥siz1-2 突变体中的转化第71-72页
        3.6.1 SlSIZ1基因正义表达载体的构建第71-72页
        3.6.2 转SlSIZ1拟南芥植株的鉴定第72页
    3.7 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体的表型第72-75页
        3.7.1 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体植株矮小的表型第72-74页
        3.7.2 SlSIZ1可以部分恢复拟南芥siz1-2 突变体对ABA敏感的表型第74页
        3.7.3 SlSIZ1部分恢复拟南芥siz1-2 突变体在逆境下的SUMO化程度第74-75页
    3.8 SlSIZ1具有SUMO E3连接酶功能第75页
    3.9 SlSIZ1基因在烟草中的遗传转化第75-80页
        3.9.1 过表达SlSIZ1基因烟草的获得第75-76页
        3.9.2 过表达SlSIZ1增加烟草的干旱抗性第76-80页
            3.9.2.1 干旱胁迫下幼苗的生长情况第76-77页
            3.9.2.2 干旱胁迫下成苗的生长情况第77-78页
            3.9.2.3 过表达SlSIZ1可以减少ROS的积累第78-80页
            3.9.2.4 过表达SlSIZ1可以促进烟草体内的SUMO化积累第80页
    3.10 SlSIZ1基因在番茄中的遗传转化第80-89页
        3.10.1 过表达SlSIZ1基因番茄的获得第80-81页
        3.10.2 过表达SlSIZ1增加番茄耐热性第81-89页
            3.10.2.1 高温胁迫下WT植株和转基因植株的生长状况第81-82页
            3.10.2.2 过表达SlSIZ1可以减少高温胁迫下番茄体内ROS的积累第82-84页
            3.10.2.3 高温相关基因表达情况第84-85页
            3.10.2.4 过表达SlSIZ1增加了番茄体内的SUMO化积累第85页
            3.10.2.5 过表达株系中有较高的Hsp70含量第85-86页
            3.10.2.6 SlHsfA1与SlSIZ1间存在互作第86-87页
            3.10.2.7 SlHsfA1可以被Sl SIZ1介导的SUMO化修饰第87-89页
4 讨论第89-96页
    4.1 逆境会诱导番茄体内的SUMO化水平并且调节SlSIZ1基因的表达第89-90页
    4.2 SlSIZ1是番茄中的SUMO E3连接酶第90-91页
    4.3 过表达SlSIZ1提高了转基因烟草的干旱和转基因番茄的高温抗性第91-92页
    4.4 过表达SlSIZ1可以降低番茄在高温和干旱胁迫下ROS的积累第92页
    4.5 过表达株系中SUMO化水平提高有利于增加干旱和高温耐受能力第92-93页
    4.6 SlSIZ1增加番茄高温耐受能力的分子机制第93-96页
5 结论第96-97页
参考文献第97-105页
致谢第105-106页
攻读学位期间发表的论文第106页

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